本文選題：MEF2A　切入點(diǎn)：基因突變　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景冠心病(CAD)在國(guó)內(nèi)外發(fā)病率和病死率均較高,一直以來(lái)是臨床及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn),其發(fā)病機(jī)制方面的研究近年來(lái)取得很大進(jìn)步。冠心病作為一種多基因疾病,吸煙、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高血壓和糖尿病在冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊病變的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。隨著分子生物及遺傳檢測(cè)手段的不斷進(jìn)展,遺傳關(guān)聯(lián)研究和全基因組連鎖分析發(fā)現(xiàn)了一些與CAD相關(guān)的易感基因位點(diǎn)和候選基因,研究已證明這些位點(diǎn)和基因直接參與冠心病的發(fā)病機(jī)制及相關(guān)危險(xiǎn)因素的調(diào)控。但由于冠心病是一種多因素復(fù)雜疾病,單個(gè)易感基因在疾病發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的作用可能很弱小,這也是目前冠心病包括心肌梗死(MI)的基因研究明顯滯后于其他疾病的原因。然而以往的研究也表明,CAD/MI可以在一些家系中呈常染色體顯性遺傳。研究者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子家族成員——肌細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子2A(MEF2A)參與了CAD的常染色體顯性遺傳形式,首次提出MEF2A為冠心病致病基因的觀點(diǎn),引起世界學(xué)者廣泛關(guān)注。2003年,Wang Q在美國(guó)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)符合常染色體顯性遺傳模式的白人家系,21個(gè)成員中有9個(gè)罹患冠心病,對(duì)家系成員進(jìn)行全基因組分析發(fā)現(xiàn)每個(gè)CAD成員的MEF2A基因都存在突變,突變位置在第11外顯子1320到1341位點(diǎn),這一位置有21個(gè)堿基缺失。在一項(xiàng)對(duì)207名經(jīng)冠脈造影證實(shí)的CAD/MI患者進(jìn)行的基因分析研究中發(fā)現(xiàn)：1.93%的患者攜帶有MEF2A突變。這些初步的研究提示MEF2A變異參與CAD/MI的發(fā)病,但這個(gè)假設(shè)并沒(méi)有得到進(jìn)一步的支持。Weng等研究者對(duì)這一觀點(diǎn)提出了質(zhì)疑,他們?cè)?00例早發(fā)冠心病的白種人中進(jìn)行MEF2A基因的檢測(cè),然而并未發(fā)現(xiàn)MEF2A基因多態(tài)性和冠狀動(dòng)脈疾病的易感性之間的聯(lián)系。一項(xiàng)愛(ài)爾蘭人群MEF2A基因的大規(guī)模研究顯示,MEF2A基因第11號(hào)外顯子21-bp缺失與缺血性心臟病無(wú)相關(guān)性。分析上述兩種截然不同的研究結(jié)果,我們認(rèn)為MEF2A突變可能是一種罕見(jiàn)的、只存在于少數(shù)家系的冠心病致病基因。MEF2A突變是否與我國(guó)的冠心病家系的發(fā)病機(jī)制相關(guān),結(jié)論將需要更多的中國(guó)CAD/MI家系基因研究來(lái)證明。目的1.根據(jù)冠心病、心肌梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn),在中國(guó)早發(fā)冠心病人群中篩選合適病例,進(jìn)行家系調(diào)查,選擇理想的CAD/MI家系；2.研究分析冠心病家系的遺傳特征、傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素、脂類代謝情況、冠狀動(dòng)脈病變情況；3.進(jìn)行家系全基因組連鎖分析,篩選CAD/MI候選基因,基因測(cè)序,尋找有意義的基因突變；4.研究中國(guó)冠心病家系中MEF2A基因第1-11外顯子的基因突變情況,與散發(fā)冠心病及健康人群對(duì)照,分析MEF2A基因突變與我國(guó)CAD/MI家系的關(guān)系。研究方法1.通過(guò)病案檢索臨床診斷明確的早發(fā)冠心病患者,進(jìn)行家系調(diào)查,篩選符合顯性遺傳特征的家系作為研究對(duì)象。研究采用的冠心病或心肌梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)為下述條件中至少存在兩個(gè)：(1)胸痛；(2)心電圖改變符合急性心肌梗死演變并與心肌酶／肌鈣蛋白顯著升高相一致；(3)冠狀動(dòng)脈CT或冠狀動(dòng)脈造影血管腔直徑狹窄率超過(guò)50%。通過(guò)篩選,確定研究家系。所有的家系成員均進(jìn)行體格檢查、血液分析檢驗(yàn)(血常規(guī)、肝腎功、血糖、血脂及血離子分析)、冠狀動(dòng)脈病變?cè)u(píng)估,并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的隨訪,包括病史、活動(dòng)耐力、藥物史和個(gè)人的生活習(xí)慣。2.收集以首發(fā)心肌梗死入院并行冠狀動(dòng)脈造影檢查證實(shí)血管病變的散發(fā)冠心病患者(n=311)作為散發(fā)CAD對(duì)照組；健康對(duì)照組(n=323)是經(jīng)過(guò)冠脈造影或冠狀動(dòng)脈CT排除冠心病的健康人群,且無(wú)早發(fā)冠心病家族史。3.微陣列比較基因組雜交(aCGH)分析：利用全血DNA提取試劑盒提取所有受試者的基因組DNA。aCGH分析冠心病家系中CAD/MI患者樣本中的DNA,正常人基因組DNA作為一個(gè)參考,我們用間隔5-kb的寡核苷酸微陣列高精度覆蓋整個(gè)基因組,拷貝數(shù)變異由患者cDNA樣本與正常對(duì)照之間log2比值確定。4. MEF2A基因檢測(cè)：采用Taq DNA聚合酶擴(kuò)增所有家系成員MEF2A基因所有外顯子和內(nèi)含子-外顯子邊界區(qū)域。引物序列包括MEF2A基因外顯子1-11。利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,出現(xiàn)異常條帶的PCR產(chǎn)物克隆到pGEM T easy載體擴(kuò)增,使用ABI 3100遺傳分析儀測(cè)序,與CAD對(duì)照組、正常對(duì)照組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)照分析。結(jié)果1.成功篩選并確定了一個(gè)有34個(gè)家庭成員(5人死亡)的CAD/MI大家系,共包括20名女性和14名男性,該家系四代均無(wú)近親婚配。先證者是一名女性,36歲發(fā)病,冠狀動(dòng)脈造影(CAG)顯示嚴(yán)重前降支病變,狹窄超過(guò)80%,無(wú)吸煙、高血壓、糖尿病及高脂血癥,符合早發(fā)冠心病診斷。此家系共發(fā)現(xiàn)7名現(xiàn)存活的CAD/MI患者,包括先證者的母親、兩個(gè)姐姐,一個(gè)哥哥、表哥和侄女均有早發(fā)冠心病(PCAD)癥狀及表現(xiàn)。2.家系成員CAD危險(xiǎn)因素分析示：家庭中僅有幾個(gè)成員有血清總膽固醇和甘油三酯輕度升高,但血清低密度和高密度脂蛋白均正常,家庭成員均沒(méi)有吸煙、高血壓病、糖尿病和肥胖病史。多元Logistic回歸分析家系成員的年齡、體重指數(shù)、膽固醇、甘油三酯水平、空腹血糖等因素與CAD/MI均無(wú)相關(guān)性。3.家系具有以下遺傳特點(diǎn)：我們分析該家系的CAD/MI遺傳特點(diǎn)為：發(fā)病不分男女性別,符合常染色體遺傳；4代人均有發(fā)病,第3代患病人數(shù)達(dá)55.6%(5/9),患者雙親中必有一方也患病,正常親屬后代未發(fā)病,這些特點(diǎn)符合顯性遺傳特點(diǎn)。4.微陣列CGH分析：家系中7例CAD/MI患者的染色體15q26中都存在50-kb的片段染色體拷貝數(shù)差異(Iog2 ratio means-0.3),這一區(qū)域包含11個(gè)重要的基因(POTEB, CXADRP2, LOC646214, GOLGA8C,OR4M2,OR4N4, LOC650137, MEF2A, OR4F4, WASH3P and FAM138E),經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)其中只有MEF2A基因與CAD的發(fā)病相關(guān),MEF2A成為最強(qiáng)的候選基因。5. MEF2A基因檢測(cè)：(1)在家系的所有成員MEF2A基因的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10外顯子SSCP分析均未發(fā)現(xiàn)有異常條帶；(2)在家系的所有7個(gè)CAD/MI患者和非CAD/MI的5個(gè)成員基因檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)MEF2A第11外顯子存在6個(gè)堿基對(duì)(CAGCCG)缺失；(3)這6個(gè)堿基對(duì)(bp)缺失位于MEF2A基因cDNA序列的1671至1676位置；(4)第11外顯子缺失的序列之中含一個(gè)CAG序列,其前方還有n個(gè)CAG重復(fù)序列；(5)家系中沒(méi)有6-bp缺失的成員均為正常表型,未發(fā)生CAD,其他存在6-bp缺失而未發(fā)生冠心病的5名家庭成員均未滿40歲；(6)CAD對(duì)照組311個(gè)CAD患者和正常對(duì)照組323健康人的MEF2A基因外顯子11編碼區(qū)域均未發(fā)現(xiàn)6-bp缺失,也未發(fā)現(xiàn)國(guó)外研究報(bào)道過(guò)的21-bp缺失。結(jié)論1.本研究成功篩選出具有顯性遺傳特征的中國(guó)冠心病家系,年齡、血壓、吸煙、血脂、血糖、體重指數(shù)等常見(jiàn)危險(xiǎn)因素與家系成員冠心病發(fā)生無(wú)相關(guān)性,證明家族遺傳因素是部分人群冠心病發(fā)生的重要原因。2.首次在中國(guó)家系研究中發(fā)現(xiàn)一種家族遺傳型冠心病與新發(fā)現(xiàn)的MEF2A基因突變密切相關(guān),這種突變是位于MEF2A基因的第11外顯子6堿基(CAGCCG)缺失,是人類MEF2A基因中發(fā)現(xiàn)一種新的突變類型。3.本研究在散發(fā)CAD及正常對(duì)照組人群中未發(fā)現(xiàn)MEF2A基因的第11外顯子6堿基(CAGCCG)缺失以及國(guó)外研究報(bào)道過(guò)的21-bp缺失,我們認(rèn)為MEF2A基因第11外顯子突變與我國(guó)散發(fā)冠心病的發(fā)生無(wú)關(guān),可能是部分CAD家系的致病基因。研究背景及目的動(dòng)脈粥樣硬化(AS)性疾病是當(dāng)今危及人類生命和健康的主要疾病之一。在眾多的致病機(jī)制中,血管內(nèi)皮功能障礙既是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié),也是其發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)。血糖代謝異常與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系十分密切。糖尿病目前是動(dòng)脈粥樣硬化(AS)和冠心病(CHD)最主要的危險(xiǎn)因素。糖尿病患者無(wú)論是否已強(qiáng)化降糖治療與非糖尿病患者相比,動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)展明顯加速。國(guó)際大規(guī)模隨機(jī)臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,AS高危人群完全戒煙、嚴(yán)格控制血壓和血脂水平,可顯著降低心血管病發(fā)病率和死亡率。然而,ACCORD、ADVANCE和VA Diabetes trials等大規(guī)模臨床實(shí)驗(yàn)顯示,在合并糖尿病的AS高危人群中將糖化血紅蛋白水平控制到正常水平,雖可降低微血管病變的發(fā)生率,但卻顯著增加大血管病變的死亡率。這些臨床實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：吸煙、高血壓和高膽固醇血癥與心血管事件是直線相關(guān)的因果關(guān)系,但血糖水平與心血管事件的關(guān)系并非如此。糖尿病促AS形成可能存在其它的分子機(jī)制和干預(yù)靶點(diǎn),尚需更加深入的基礎(chǔ)研究加以闡明。目前研究認(rèn)為,高血糖可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,誘導(dǎo)黏附分子、趨化因子等炎性介質(zhì)釋放,激活炎癥反應(yīng),還可通過(guò)引起氧化應(yīng)激、脂代謝紊亂、胰島素抵抗、糖基化終產(chǎn)物增加導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,是動(dòng)脈粥樣硬化形成中的重要影響因素。高血糖引起血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜,許多細(xì)胞因子、信號(hào)通路的作用目前還不十分明確,尋找血糖控制以外的其它干預(yù)保護(hù)措施也是防治糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的重要環(huán)節(jié)。Kruppel樣因子(KLF)是具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)亞家族。研究結(jié)果顯示KLF2可以參與調(diào)節(jié)血管炎癥、凝血、血管舒縮和生成等多種過(guò)程,直接或間接保護(hù)內(nèi)皮功能,是AS形成過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子,并且是他汀類藥物的重要作用靶點(diǎn),因此在AS形成過(guò)程中具有重要的作用。KLF2對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的影響至今尚未見(jiàn)有關(guān)研究報(bào)道,根據(jù)以往的基礎(chǔ)研究我們推測(cè)KLF2在高血糖與血管內(nèi)皮功能障礙的發(fā)生機(jī)制中也應(yīng)發(fā)揮重要的作用。本研究的目的通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討轉(zhuǎn)錄因子KLF2在高糖條件下是否對(duì)血管內(nèi)皮功能具有重要的保護(hù)作用,闡明可能的分子機(jī)制及干預(yù)措施,為防治糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化提供重要治療靶點(diǎn)。材料與方法1.細(xì)胞培養(yǎng)及存活率測(cè)定：離體培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),用不同濃度梯度及時(shí)間梯度的高糖干預(yù),MTT比色法測(cè)定細(xì)胞存活率最終確定高糖誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞模型為25.5mmol/L的D-葡萄糖誘導(dǎo)24h。2.細(xì)胞干預(yù)：采用25.5mmol/L高糖及不同濃度阿托伐他汀、羅格列酮實(shí)現(xiàn)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞KLF2表達(dá)的干預(yù),以SB203580來(lái)抑制p38MAPK活性,分別采用5.6mmol/L葡萄糖、5.6mmol/L葡萄糖+19.9 mM甘露醇干預(yù)細(xì)胞作對(duì)照組。3. RT-PCR:收集各組細(xì)胞,提取RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR,分別檢測(cè)各組細(xì)胞中KLF2、PPARγ、VCAM-1和ICAM-1 mRNA的表達(dá)水平。4. Western blotting:收集各組細(xì)胞,提取蛋白,分別檢測(cè)KLF2、VCAM-1、ICAM-1、p38MAPK、 p-p38MAPK、PPARγ的蛋白表達(dá)水平。5.NO檢測(cè)：收集各組細(xì)胞上清液,采用試劑盒檢測(cè)NO釋放。研究結(jié)果1. 與5.6mmol/L葡萄糖及5.6mmol/L葡萄糖+甘露醇組對(duì)照,25.5mmol/L高糖刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h可明顯減低KLF2 mRNA及蛋白的表達(dá),增高炎性因子VCAM-1、ICAM-1水平,減少NO的釋放,KLF2與VCAM-1、ICAM-1、NO變化趨勢(shì)顯著相關(guān)；2. 以阿托伐他汀(0.1μM,1μM,10μM)、羅格列酮(0.1μM,1μM,10μM)分別干預(yù)高糖刺激的HUVECs能明顯增加KLF2表達(dá)和NO的釋放,降低VCAM-1、 ICAM-1蛋白和mRNA表達(dá),這種改變?cè)诎⑼蟹ニ〗M呈劑量依賴性,藥物濃度越高越明顯；3.與對(duì)照組比較,高糖刺激后的HUVECs磷酸化的p38 MAPK表達(dá)增強(qiáng),給與p38 MAPK特異性抑制劑SB203580后,KLF2的表達(dá)增加；中等濃度阿托伐他汀、羅格列酮(1μM)就能明顯抑制高糖對(duì)HUVEC p38 MAPK的磷酸化作用。結(jié)論1.高濃度葡萄糖能誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥因子VCAM-1、ICAM-1表達(dá)增加,減少舒張因子NO的釋放,導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙,內(nèi)皮功能保護(hù)性轉(zhuǎn)錄因子KLF2能部分抑制高濃度葡萄糖所引起的炎癥反應(yīng),保護(hù)血管內(nèi)皮功能；2.高濃度葡萄糖可以通過(guò)p38 MAPK途徑抑制HUVECs KLF2表達(dá)；3.阿托伐他汀、羅格列酮可以通過(guò)改善高糖對(duì)HUVECs轉(zhuǎn)錄因子KLF2的抑制作用,減少炎性因子VCAM-1、ICAM-1的表達(dá),增加NO的釋放。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R541.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1708565