本文選題：環(huán)指蛋白R(shí)NF6　切入點(diǎn)：啟動(dòng)子　出處：《蘇州大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分RNF6在惡性血液腫瘤中功能的初步分析目的:目前,環(huán)指蛋白R(shí)NF6在惡性血液腫瘤中的功能及其分子機(jī)制尚未報(bào)道。本項(xiàng)目首先檢測(cè)了RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病病人樣本以及細(xì)胞株中的表達(dá)情況,并利用慢病毒過表達(dá)系統(tǒng)和sh RNA干擾技術(shù)分析RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病細(xì)胞中的作用,以期闡述RNF6在惡性血液腫瘤中的相關(guān)功能。(1)通過q-RT-PCR和RT-PCR方法檢測(cè)了病人樣本以及正常骨髓(NBM)樣本中RNF6的m RNA表達(dá)水平;(2)利用Immunoblotting技術(shù)檢測(cè)了RNF6在6種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株(H929、KMS11、LP1、OCI-My5、OPM2和RPMI-8226)以及7種白血病細(xì)胞株(AML2、HL60、NB4、THP1、K562、Jurkat和697)中的表達(dá)豐度;(3)通過生長(zhǎng)曲線和集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過表達(dá)RNF6對(duì)白血病細(xì)胞增殖以及集落形成能力的影響;(4)利用sh RNA干擾技術(shù)檢測(cè)沉默RNF6對(duì)白血病細(xì)胞增殖的影響;(5)通過臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法檢測(cè)白血病細(xì)胞中過表達(dá)RNF6對(duì)硼替佐米敏感性的影響。結(jié)果：(1)采用q-RT-PCR和RT-PCR對(duì)病人樣本和正常骨髓樣本中RNF6的表達(dá)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)RNF6的m RNA水平在惡性血液病病人樣本中存在高表達(dá);(2)與正常骨髓樣本相比,RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病細(xì)胞株中蛋白質(zhì)水平比較高;(3)生長(zhǎng)曲線和集落生成實(shí)驗(yàn)表明,過表達(dá)RNF6能夠顯著促進(jìn)白血病細(xì)胞生長(zhǎng)和集落形成能力;(4)sh RNA沉默RNF6能夠明顯抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng);(5)利用慢病毒介導(dǎo)RNF6,使之在白血病細(xì)胞中高表達(dá),可以顯著減弱K562對(duì)硼替佐米的藥物敏感性。小結(jié)：RNF6在多種多發(fā)性骨髓瘤和白血病的病人樣本和細(xì)胞株中均存在異常高表達(dá)。同時(shí),過表達(dá)或者沉默RNF6以后,都能顯著地促進(jìn)或者抑制癌細(xì)胞增殖。以上這些結(jié)果表明,RNF6可能與惡性血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。另外,過表達(dá)RNF6可以減弱K562細(xì)胞對(duì)硼替佐米的藥物敏感性,這提示,RNF6還可能與癌細(xì)胞的耐藥性相關(guān)。第二部分5AHQ對(duì)RNF6的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制分析目的:已有研究發(fā)現(xiàn),喹啉類似物5AHQ具有很強(qiáng)的抗多發(fā)性骨髓瘤和抗白血病活性。同時(shí),前期通過DNA Microarray發(fā)現(xiàn),5AHQ可以顯著影響RNF6的m RNA水平。本項(xiàng)目將進(jìn)一步闡述RNF6的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,從而進(jìn)一步揭示5AHQ抗腫瘤的相關(guān)分子機(jī)制。(1)多發(fā)性骨髓瘤和白血病細(xì)胞株經(jīng)5AHQ加藥處理24小時(shí)后,利用MTT法檢測(cè)藥物的細(xì)胞毒活性;(2)5AHQ分別處理多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株(OCI-My5和RPMI-8226)和白血病細(xì)胞株(AML2和K562)24小時(shí)后,提取細(xì)胞總蛋白和總RNA,分別經(jīng)Immunoblotting或者RT-PCR檢測(cè)RNF6的蛋白或m RNA水平;(3)UCSC網(wǎng)站預(yù)測(cè)RNF6的啟動(dòng)子序列,并構(gòu)建RNF6的啟動(dòng)子截?cái)囿w,然后利用熒光素酶雙基因報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)RNF6啟動(dòng)子截?cái)囿w的熒光素酶活性;(4)利用TFSearch軟件預(yù)測(cè)RNF6核心啟動(dòng)子上可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),并對(duì)其進(jìn)行點(diǎn)突變和缺失突變,檢測(cè)預(yù)測(cè)位點(diǎn)對(duì)啟動(dòng)子活性的影響;(5)利用CHIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Pbx1與RNF6啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況;(6)利用熒光素酶雙基因報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)Pbx1/Prep1/MEIS1對(duì)RNF6啟動(dòng)子活性的影響;(7)利用Co-IP檢測(cè)5AHQ對(duì)Pbx1/Prep1異源二聚體形成的影響;同時(shí)利用熒光素酶雙基因報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)5AHQ對(duì)RNF6核心啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果：(1)MTT結(jié)果顯示,5AHQ能夠顯著抑制多發(fā)性骨髓瘤和白血病細(xì)胞的存活;(2)5AHQ分別處理骨髓瘤和白血病細(xì)胞株后,RNF6的m RNA和蛋白水平均顯著下調(diào),這說明5AHQ可以下調(diào)RNF6的轉(zhuǎn)錄并抑制其蛋白的表達(dá);(3)通過缺失突變分析發(fā)現(xiàn),-365/-99是RNF6的核心啟動(dòng)子區(qū)域,具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性;(4)利用定點(diǎn)突變和缺失突變技術(shù)發(fā)現(xiàn),RNF6核心啟動(dòng)子區(qū)域中的Pbx1結(jié)合位點(diǎn)能夠顯著調(diào)控RNF6的啟動(dòng)子活性;(5)CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Pbx1可以和RNF6啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合;(6)當(dāng)單轉(zhuǎn)染Pbx1時(shí),并不能顯著上調(diào)RNF6的啟動(dòng)子活性,而當(dāng)Pbx1與Prep1共轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn),可以顯著上調(diào)RNF6的啟動(dòng)子活性,這說明,Pbx1需要形成異源二聚體后才能調(diào)控RNF6的轉(zhuǎn)錄;(7)5AHQ可以顯著抑制Pbx1/Prep1異源二聚體的形成,以及明顯下調(diào)RNF6核心啟動(dòng)子的活性。小結(jié)：進(jìn)一步證實(shí)了5AHQ可以顯著抑制骨髓瘤和白血病細(xì)胞存活,并且可以通過抑制Pbx1/Prep1異源二聚體的形成來調(diào)控RNF6的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。其中也發(fā)現(xiàn),-365/-99為RNF6的核心啟動(dòng)子,Pbx1轉(zhuǎn)錄因子可以介導(dǎo)RNF6的轉(zhuǎn)錄。第三部分RNF6泛素化特點(diǎn)的分析目的:RNF6屬于環(huán)指蛋白家族,環(huán)指蛋白家族成員一般都可以發(fā)生自身泛素化。本部分將考察RNF6的泛素化情況并尋找其特異性泛素化位點(diǎn),從而進(jìn)一步揭示RNF6的泛素化機(jī)制。(1)分別加入溶酶體抑制劑(NH4Cl和Chloroquine)以及蛋白酶體抑制劑(MG132和Lactacystin)考察RNF6通過何種方式發(fā)生降解;(2)利用免疫共沉淀方法(Co-IP)檢測(cè)RNF6的泛素化情況;(3)通過定點(diǎn)突變技術(shù)(Lysine突變成Arginine)構(gòu)建RNF6一系列單點(diǎn)突變體、三點(diǎn)突變體和四點(diǎn)突變體,然后通過MG132處理分析這些突變體的泛素化降解情況;(4)通過CHX Chase實(shí)驗(yàn)檢測(cè)WT,K0,K608和K608R蛋白的半衰期;(5)通過轉(zhuǎn)染一系列不同的去泛素化酶,檢測(cè)RNF6的去泛素化情況。結(jié)果：(1)蛋白酶體抑制劑MG132和Lactacystin能夠顯著聚集RNF6蛋白,而溶酶體抑制劑NH4Cl和Chloroquine并不能影響RNF6蛋白量,這提示RNF6主要通過蛋白酶體途徑進(jìn)行降解;(2)通過Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),RNF6蛋白能夠形成顯著的多聚泛素鏈,同時(shí)加入蛋白酶體抑制劑后,RNF6蛋白的多聚泛素鏈明顯增多,這說明RNF6蛋白能夠發(fā)生多聚泛素化;(3)通過點(diǎn)突變分析發(fā)現(xiàn),RNF6中第608位賴氨酸位點(diǎn)發(fā)生突變后,能夠明顯阻斷RNF6的泛素-蛋白酶體降解,表明K608為RNF6的重要泛素化位點(diǎn)。但是K0(Lysine-free)依然能夠發(fā)生一定程度的泛素化,這說明除了賴氨酸位點(diǎn)外,可能還存在其它的氨基酸位點(diǎn)介導(dǎo)RNF6的泛素化,如半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等;(4)CHX Chase實(shí)驗(yàn)表明,K608R顯著延長(zhǎng)了RNF6蛋白的半衰期;(5)通過共轉(zhuǎn)染一系列去泛素化酶質(zhì)粒發(fā)現(xiàn),某些DUBs可以明顯上調(diào)RNF6的表達(dá)水平,其中USP22得到了進(jìn)一步的論證。小結(jié)：環(huán)指蛋白R(shí)NF6主要通過泛素-蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。同時(shí),RNF6能夠發(fā)生多聚泛素化,其中K608為RNF6的重要泛素化位點(diǎn)。另外通過去泛素化酶篩選發(fā)現(xiàn),USP22可能為RNF6的去泛素化酶。第四部分RNF6促進(jìn)GR的泛素化并增強(qiáng)其穩(wěn)定性目的:近期有研究發(fā)現(xiàn),RNF6作為E3(泛素連接酶)可以介導(dǎo)雄激素受體AR發(fā)生非典型泛素化而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。但在血液病細(xì)胞中的機(jī)制還不清楚。據(jù)此,本項(xiàng)目將探索RNF6是否能夠影響多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素受體GR的相關(guān)功能,從而更進(jìn)一步闡述RNF6在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。方法：(1)通過Immunoblotting檢測(cè)骨髓瘤和白血病細(xì)胞株中GR和RNF6的蛋白表達(dá)豐度,并檢測(cè)骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)5AHQ處理后GR和RNF6的蛋白表達(dá)趨勢(shì);(2)通過質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法研究RNF6對(duì)GR蛋白表達(dá)的影響;(3)CHX chase實(shí)驗(yàn)考察RNF6對(duì)GR蛋白半衰期的影響;(4)Co-IP分析RNF6與GR是否存在相互作用;(5)利用缺失突變技術(shù)構(gòu)建一系列RNF6與GR的截?cái)囿w,再通過Co-IP實(shí)驗(yàn)分析RNF6與GR在哪一區(qū)域發(fā)生相互作用;(6)通過Co-IP分析RNF6能否介導(dǎo)GR發(fā)生泛素化;(7)使用地塞米松(Dex)或MG132處理分析RNF6對(duì)Dex誘導(dǎo)的GR降解的影響。結(jié)果：(1)RNF6和GR的蛋白表達(dá)豐度基本一致,而且不同骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)5AHQ處理后發(fā)現(xiàn),GR和RNF6蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致,這暗示RNF6與GR可能存在一定的關(guān)聯(lián)性;(2)RNF6能夠上調(diào)外源性和內(nèi)源性GR蛋白水平,而GR的m RNA水平并沒有發(fā)生變化,這提示RNF6通過影響GR的翻譯后修飾上調(diào)GR蛋白水平;(3)通過CHX chase實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),RNF6能夠延長(zhǎng)GR蛋白的半衰期;(4)Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),RNF6與GR存在相互作用關(guān)系;(5)缺失突變分析發(fā)現(xiàn),GR蛋白的531-777區(qū)域與RNF6發(fā)生結(jié)合,RNF6蛋白的87-482區(qū)域與GR發(fā)生結(jié)合;(6)通過Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),RNF6能夠促進(jìn)GR發(fā)生非降解型的多聚泛素化,即非典型泛素化;(7)RNF6能夠抑制Dex介導(dǎo)的GR蛋白降解。小結(jié)：RNF6與GR存在相互作用,并且RNF6結(jié)合在GR的LBD結(jié)構(gòu)域區(qū)域。另外,RNF6作為E3泛素連接酶,能夠促進(jìn)GR發(fā)生非典型泛素化而導(dǎo)致其發(fā)生穩(wěn)定。同時(shí),RNF6能夠抑制地塞米松所誘導(dǎo)的GR的降解。結(jié)論本研究首先分析了RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病病人樣本和細(xì)胞株中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)RNF6存在高表達(dá)。另外,通過慢病毒過表達(dá)和干擾系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn),RNF6方法:能夠影響K562細(xì)胞的增殖以及對(duì)硼替佐米的敏感性,以上這些結(jié)果表明RNF6可能與惡性血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),抗血液腫瘤化合物5AHQ能夠影響RNF6的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步對(duì)RNF6的啟動(dòng)子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn),-365/-99為RNF6的核心啟動(dòng)子區(qū)域,同時(shí)轉(zhuǎn)錄因子Pbx1與TALE家族蛋白如Prep1等形成異源二聚體后,能夠調(diào)控RNF6的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。而且,5AHQ可以通過抑制Pbx1與Prep1的異源二聚化,從而抑制RNF6啟動(dòng)子的活化。另外,由于RNF6為環(huán)指家族蛋白,能夠發(fā)生自身泛素化,并主要通過泛素-蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。同時(shí)也對(duì)RNF6的泛素化位點(diǎn)進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)RNF6中的賴氨酸位點(diǎn)K608發(fā)生突變后,可以顯著抑制RNF6的泛素化降解,這提示K608為RNF6的重要泛素化位點(diǎn)。然而,K0(Lysine-free)仍然能夠發(fā)生一定程度的泛素化,這表明除了賴氨酸位點(diǎn)外,還存在其它泛素化位點(diǎn)介導(dǎo)RNF6的泛素化,如半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等。另外,通過探索RNF6與多發(fā)性骨髓瘤中GR的關(guān)系發(fā)現(xiàn),RNF6與GR能夠發(fā)生結(jié)合,并且RNF6結(jié)合在GR的LBD結(jié)構(gòu)域區(qū)域。另外,作為E3泛素連接酶的RNF6能夠誘導(dǎo)GR發(fā)生非典型泛素化而增強(qiáng)其穩(wěn)定性。同時(shí),RNF6能夠阻斷地塞米松所誘導(dǎo)的GR的降解。這些結(jié)果表明,RNF6可能與GC/GR信號(hào)通路相關(guān)�？傊�,本項(xiàng)目首次報(bào)道了RNF6在惡性血液腫瘤(尤其是多發(fā)性骨髓瘤和白血病)中的相關(guān)功能及其分子機(jī)制,相信能為以后開發(fā)以RNF6為靶點(diǎn)的藥物奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733

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本文編號(hào)：1654299