本文選題：溶血磷脂酸　切入點(diǎn)：氧化損傷　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：心血管疾病嚴(yán)重危害人類健康，其發(fā)病率和死亡率極高，全世界每年死于此類疾病的患者高達(dá)1900萬(wàn)，居各種致死性疾病的首位。心肌梗死（Myocardialinfarction，MI）是心血管疾病患者死亡的主要原因之一，動(dòng)脈搭橋術(shù)、溶栓治療和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)（PCI）的廣泛應(yīng)用，顯著改善了MI病人的愈后。然而部分心肌梗死患者在恢復(fù)血流灌注后，心肌功能不僅沒有恢復(fù)，反而進(jìn)一步惡化，發(fā)生心肌缺血再灌注（Myocardial ischemia/reperfusion，I/R）損傷。大量研究表明，活性氧(reactive oxygen species，ROS）參與了心肌的病理?yè)p傷過程，在心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷和心肌肥厚等一系列心功能障礙疾病中發(fā)揮重要作用。ROS是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧簇，是氧分子的不完全代謝產(chǎn)物。正常生理情況下，機(jī)體內(nèi)的氧化與抗氧化過程處于動(dòng)態(tài)平衡中，但是當(dāng)細(xì)胞或組織缺血缺氧時(shí)，ROS清除系統(tǒng)功能降低或喪失，而其生成系統(tǒng)功能增強(qiáng)，使機(jī)體內(nèi)氧化物的生成超過氧化物的清除，從而導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的失衡，機(jī)體發(fā)生氧化損傷。H2O2是活性氧的一種，能夠自由通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被廣泛應(yīng)用于模擬氧化損傷模型的制備。 溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）是目前已知結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的甘油磷脂，普遍存在于哺乳動(dòng)物的體液當(dāng)中，由激活的血小板釋放，能夠作用于G蛋白耦聯(lián)受體，在體內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。近年來，脂類代謝產(chǎn)物的蓄積與缺血性心血管疾病的關(guān)系受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。大量的臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，許多缺血性心血管疾病的發(fā)生均伴隨有LPA濃度的增加，并且LPA的濃度與心血管疾病的嚴(yán)重程度及愈后關(guān)系密切。目前已有大量研究表明LPA在心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化和心肌肥大等心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。心肌梗死后LPA濃度大幅增加，LPA參與急性心肌梗死后早期心肌細(xì)胞凋亡和晚期心肌重塑過程。本課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)，LPA能夠增加心肌梗死后心律失常的發(fā)生率。 有報(bào)道指出，LPA對(duì)心肌不同部位細(xì)胞的電生理作用不同，這也提示我們LPA對(duì)心肌梗死后損傷和正常部位的心肌細(xì)胞也可能發(fā)揮不同作用。本課題組的前期工作觀察到LPA能夠增大急性分離的豚鼠心肌細(xì)胞的鈣電流，延長(zhǎng)豚鼠乳頭肌動(dòng)作電位時(shí)程，但是LPA對(duì)氧化損傷后心肌細(xì)胞電生理特性的影響尚未做進(jìn)一步研究，并且目前尚未見相關(guān)報(bào)道。 本研究以原代培養(yǎng)的大鼠乳鼠心室肌細(xì)胞為研究對(duì)象，探討LPA對(duì)原代培養(yǎng)的正常及氧化損傷的心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程和L-型鈣電流的影響，并探討其可能的分子機(jī)制，為闡明缺血性心血管疾病的發(fā)病機(jī)理提供新的理論依據(jù)。 本研究主要進(jìn)行以下幾方面的工作： 1. LPA對(duì)心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程的影響 采用全細(xì)胞膜片鉗方法檢測(cè)LPA對(duì)原代乳鼠心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程（APD）的影響，結(jié)果顯示LPA（5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L）能夠延長(zhǎng)心室肌細(xì)胞的APD，并且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，作用效果逐漸增強(qiáng)。氧化損傷后心室肌細(xì)胞的APD縮短；LPA作用于氧化損傷心室肌細(xì)胞2h和4h后，心室肌細(xì)胞的APD均有不同程度的延長(zhǎng)，而LPA作用8h和24h后，APD反而縮短。 2. LPA對(duì)心室肌細(xì)胞L-型鈣電流的影響 采用全細(xì)胞膜片鉗和細(xì)胞貼附式膜片鉗方法檢測(cè)LPA對(duì)原代乳鼠心室肌細(xì)胞L-型鈣電流（ICa-L）的影響，結(jié)果顯示LPA能夠增大心室肌細(xì)胞的ICa-L，并增加單通道的開放概率。氧化損傷后心室肌細(xì)胞的ICa-L減小，但是單通道的開放概率無明顯變化。LPA作用于氧化損傷心室肌細(xì)胞2h和4h后，心室肌細(xì)胞的ICa-L增加，而LPA作用8h和24h后，ICa-L反而減小。LPA能夠增大氧化損傷心室肌細(xì)胞鈣通道的單通道開放概率。 3. LPA對(duì)心室肌細(xì)胞CaV1.2mRNA表達(dá)的影響 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法在基因水平上檢測(cè)LPA對(duì)原代心室肌細(xì)胞編碼L-型鈣通道α1c亞基的基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，10μmol/L的LPA對(duì)心室肌細(xì)胞CaV1.2mRNA的表達(dá)無顯著影響；氧化損傷后心室肌細(xì)胞CaV1.2mRNA的表達(dá)降低；LPA作用于氧化損傷心室肌細(xì)胞2h后，CaV1.2mRNA的表達(dá)無顯著變化，LPA作用4h后，CaV1.2mRNA的表達(dá)減少，8h和24h后CaV1.2mRNA進(jìn)一步減少。 4. LPA對(duì)心室肌細(xì)胞CaV1.2蛋白表達(dá)的影響 采用Western blot方法在蛋白水平上檢測(cè)LPA對(duì)編碼心室肌細(xì)胞L-型鈣通道α1c亞基蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，LPA對(duì)心室肌細(xì)胞CaV1.2蛋白的表達(dá)無顯著影響；氧化損傷后心室肌細(xì)胞CaV1.2蛋白的表達(dá)降低；LPA作用于氧化損傷心室肌細(xì)胞2h和4h后，CaV1.2蛋白的表達(dá)無顯著變化，LPA作用8h后，CaV1.2蛋白的表達(dá)減少，24h后進(jìn)一步減少。 5. LPA對(duì)心室肌細(xì)胞CaN活性的影響 采用分光光度計(jì)測(cè)吸光值的方法檢測(cè)LPA對(duì)心室肌細(xì)胞CaN活性的影響。結(jié)果顯示，LPA對(duì)原代心室肌細(xì)胞的CaN活性無顯著影響，氧化損傷后CaN活性增強(qiáng)，LPA能夠進(jìn)一步增加氧化損傷心室肌細(xì)胞的CaN活性。 6. LPA對(duì)心室肌細(xì)胞NFAT核轉(zhuǎn)位的影響 采用細(xì)胞熒光染色的方法檢測(cè)LPA對(duì)心室肌細(xì)胞NFAT核轉(zhuǎn)位的影響。結(jié)果顯示，，LPA對(duì)原代心室肌細(xì)胞的NFAT核轉(zhuǎn)位無影響，氧化損傷后NFAT向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，LPA能夠進(jìn)一步促進(jìn)氧化損傷心室肌細(xì)胞的NFAT核轉(zhuǎn)位。 7. FK-506對(duì)LPA引起的心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程(APD)和L-型鈣電流(ICa-L)變化的抑制作用 采用全細(xì)胞膜片鉗、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot方法檢測(cè)了CaN特異性阻斷劑FK-506對(duì)LPA處理的心室肌細(xì)胞APD、ICa-L、CaV1.2mRNA和蛋白的影響。對(duì)于氧化損傷的心室肌細(xì)胞，F(xiàn)K-506能夠抑制LPA引起的APD、ICa-L、CaV1.2mRNA和蛋白的減小。 本研究首次探討了LPA對(duì)原代培養(yǎng)的正常及氧化損傷心室肌細(xì)胞的不同作用。LPA通過增大原代培養(yǎng)的心室肌細(xì)胞L-型鈣通道的單通道開放概率，使L-型鈣電流增大，動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)；氧化損傷后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度大量增加，激活了CaN-NFAT信號(hào)通路，下調(diào)L-型鈣通道蛋白的表達(dá)，使L-型鈣電流減小，LPA進(jìn)一步增加CaN-NFAT信號(hào)通路的活性，減小L-型鈣電流。LPA能夠增大氧化損傷心室肌細(xì)胞鈣通道的單通道開放概率，使L-型鈣電流增大，但是隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，CaN-NFAT信號(hào)通路對(duì)L-型鈣通道蛋白的調(diào)節(jié)發(fā)揮了主要作用，故LPA最終減小氧化損傷心室肌細(xì)胞的L-型鈣電流和動(dòng)作電位時(shí)程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R54

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1642991