本文選題：條件性靶細胞清除　切入點：hCD59　出處：《山東大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的近三十年,生物學研究在不斷更新的科學技術帶動下得到了快速發(fā)展。在基因水平的研究中,無論是在體內(nèi)還是體外,靶基因敲除和過表達技術已經(jīng)成為研究特定基因功能的強有力的手段。在細胞水平的研究中,針對靶細胞群體的體內(nèi)清除對研究特定細胞群體的功能和疾病的關系有重要價值。更重要的是,特異性細胞清除還適用于研究細胞的再生、細胞和組織分化,這對再生醫(yī)學的發(fā)展有著深遠的意義。然而,目前體內(nèi)清除細胞技術與基因敲除技術相比相對落后和有限。早期的體內(nèi)細胞清除研究主要使用諸如外科手術的方法在小鼠體內(nèi)清除靶細胞群,例如,通過顯微解剖、激光清除和抗體介導的細胞清除。但是由于這些方法往往存在技術難度、重復率低、造價高、效果差和對非靶細胞有毒性等弊端,其使用受到限制。近年來,基因工程學方法開始用于細胞的體內(nèi)清除,包括：通過轉(zhuǎn)基因技術在靶細胞中表達C aspase-3或 Caspace-8來促使靶細胞凋亡、在靶細胞表面表達單皰疹病毒1胸苷激酶(Herpes simplex virus 1 thymidine kinase, HSVtk)或者白喉毒素(Diphtheria toxin, DT)受體(DT receptor, DTR),再用核苷類似物或DT毒素在小鼠體內(nèi)清除靶細胞。雖然這些方法大大提高了體內(nèi)清除靶細胞的效率,但仍然存在不可忽視的弊端。通過轉(zhuǎn)基因表達Caspase-3或Caspase-8誘導靶細胞凋亡對實驗動物仍然存在毒性,而且清除靶細胞的速率很低。HSVtk轉(zhuǎn)基因小鼠模型只能用于清除進行分裂的細胞,而對于未進行分裂的細胞不適用。DT/DTR介導的細胞清除是近二十年來應用最廣泛的模型,但DT本身的毒性作用導致它的藥理學安全窗口很窄,在實際研究中很難進行劑量依賴性細胞清除研究。故迫切需要建立一種更有效、簡便和安全窗口大的細胞清除方法。中間鏈球菌毒素(Inrermedilysin, ILY)是一種由中間鏈球菌分泌的膽固醇依賴性細胞溶解素�？赏ㄟ^和細胞表面的人補體調(diào)節(jié)蛋白CD59分子特異結合發(fā)生多聚化,然后在細胞膜上形成細胞毒性孔道來裂解人的細胞。由于ILY僅選擇性結合人的CD59 (human CD59, hCD59),而不結合其他種屬的CD59,故對動物來說是很安全的。我們實驗室在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ILY在hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)可選擇性有效清除表達hCD59的紅細胞和內(nèi)皮細胞。提示hCD59聯(lián)合ILY對細胞的殺傷可以成為一種新的動物體內(nèi)細胞清除方法。但如何利用簡單的方法建立多種靶細胞特異表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠,以便利用ILY選擇性清除靶細胞、使這種模型有更廣泛的應用價值,成為亟待解決的問題。Cre是一種噬菌體的重組酶,它可以通過識別兩個鄰近的LoxP位點對位點間的基因序列進行環(huán)化切除,已被廣泛應用于條件性基因敲除或條件性敲入小鼠的制備。如果能建立帶有LoxP的hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠,將可利用現(xiàn)有的千余種細胞特異性表達Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠,制備出依賴Cre表達調(diào)控細胞特異性表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠,進而用ILY方便地選擇性清除多種靶細胞。因此本論文的目標為：1.制備LoxP-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠(ihCD59、鼠),并通過與細胞特異性表達Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠(Cre+小鼠)雜交,獲得細胞特異性表達hCD59的雙轉(zhuǎn)基因小鼠(Cre+ ihCD59+小鼠)。2.通過注射ILY在生理條件下和不同疾病模型中檢測其對小鼠體內(nèi)多種靶細胞的清除效果,研究其在細胞再生、修復和疾病研究中的應用。方法一, LoxP-Stop-LoxP-hCD59小鼠和細胞特異性表達人CD59轉(zhuǎn)基因小鼠的制備(一) Lox-Stop-Lox-hCD59重組表達載體的構建1.制備Cre條件性表達hCD59載體通過將hCD59開放讀碼框插入CAG啟動子及兩端有LoxP位點的STOP轉(zhuǎn)錄終止元件(LSL)的下游,得到pCAG-LSL-hCD59載體。2.體外驗證pCAG-LSL-hCD59載體的Cre依賴性在NIH 3T3細胞中共轉(zhuǎn)染pCAG-LSL-hCD59載體和Cre重組酶表達載體(Cre+)或者單獨轉(zhuǎn)染pCAG-LSL-hCD59載體(Cre-),轉(zhuǎn)染48小時后用hCD59熒光染色檢測細胞表面hCD59分子表達情況。(二)LSL-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠(ihCD59小鼠)的制備利用TARGATT技術,把CAG-LSL-hCD59的載體序列和體外轉(zhuǎn)錄得到的mRNA混合物通過TARGATTTM技術顯微注射入80個FVB遺傳背景的受精卵前核中,然后這些受精卵被移植入四只CD1培育小鼠體內(nèi)。通過TARGATTTM載體上的attB位點和染色體上的attP位點之間的遺傳重組,轉(zhuǎn)基因CAG-LSL-hCD59被整合在H11位點。顯微注射后共得到了23只子代小鼠,利用PCR檢測小鼠基因組DNA中是否成功整合了LSL-hCD59序列。(三)系統(tǒng)表達Cre和hCD59雙轉(zhuǎn)基因小鼠的制備1.獲得系統(tǒng)表達hCD59的Meox2Cre+ihCD59+小鼠將ihCD59小鼠與系統(tǒng)表達Cre的Meox2Cre+小鼠雜交。在子代小鼠中通過基因鑒定得到基因組表達hCD59的Meox2Cre+ihCD59+雙轉(zhuǎn)基因小鼠和沒有hCD59表達的Meox2Cre-ihCD59+小鼠(雙轉(zhuǎn)基因小鼠中的+代表+/-雜合子)。2.檢測Meox2Cre+ihCD59+小鼠體內(nèi)hCD59在各個器官的表達通過流式細胞術和免疫組織化學染色確定hCD59在Meox2Cre+ihCD59+小鼠的循環(huán)系統(tǒng)和各器官中的表達情況。以Meox2Cre-ihCD59+小鼠和C57BL/6小鼠作為對照。(四)多種細胞特異性表達Cre和hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠的制備1.T細胞、髓系細胞和樹突狀細胞特異表達hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠的制備1)通過雜交誘導hCD59在T細胞、單核細胞和樹突狀細胞表達：為了使hCD59特異的表達在T細胞、單核細胞和樹突狀細胞中,首先將ihCD59小鼠與多個Cre特異表達的小鼠雜交,包括LckCre+小鼠、LyzCre+、鼠和(CD11cCre+、鼠。通過基因鑒定在子代小鼠中得到hCD59表達陽性的Cre+ihCD59+雙轉(zhuǎn)基因小鼠。2)檢測hCD59的表達特異性：通過流式細胞術檢測hCD59在各個子代Cr+ihCD59+雙轉(zhuǎn)基因小鼠品系外周血中的表達。2.肝臟細胞和膽管上皮細胞特異表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠系的制備1)用多個方法誘導hCD59特異的在肝細胞和膽管上皮細胞中表達：①用ihCD59小鼠和AlbCre+小鼠雜交使hCD59在子代小鼠的肝細胞和膽管上皮細胞中同時表達。②用Alb啟動子調(diào)控的腺病毒表達載體Ad-AlbCre+感染ihCD59小鼠使hCD59在小鼠肝細胞中表達。③用ihCD59小鼠和tamoxifen誘導性5ox9creERT+小鼠雜交使hCD59在子代小鼠的膽管上皮細胞中表達。2)檢測hCD59在肝臟細胞中的表達：用hCD59抗體和膽管上皮細胞標志分子CK19進行免疫熒光染色檢測,檢測肝細胞和膽管上皮細胞中hCD59的特異表達。3.星形膠質(zhì)細胞特異表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠的制備1)制備有hCD59表達的mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠：用ihCD59小鼠和mGFAP-Cre+、鼠雜交,通過基因鑒定得到hCD59表達的mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠。2)檢驗hCD59在星型膠質(zhì)細胞中的特異表達：對mGFAP-CreihCD59+小鼠的腦冰凍切片進行GFAP和hCD59的免疫熒光共染色,確定hCD59在星形膠質(zhì)細胞中的特異表達。二、ILY/ihCD59介導的靶細胞清除方法在生理和病理條件下的應用(一)ILY的制備及活力測定和藥理學特性的測定1.ILY的表達、純化及活性檢測1)將裝載有重組ILY的表達載體轉(zhuǎn)染到XL1-blue大腸桿菌中。用TB培養(yǎng)基搖菌,待培養(yǎng)液OD600達到0.5左右時加入IPGT誘導蛋白質(zhì)大量表達。過夜培養(yǎng)后通過離心將菌體收集。2)用裂解液結合高速離心裂解大腸桿菌,通過His親和柱分離純化大腸桿菌裂解液中帶有His標記的重組ILY。3)將含洗脫的ILY加到內(nèi)毒素親和柱上,按照說明書濾出的即為無內(nèi)毒素的ILY。4)將ILY加入透析膜進行透析48小時去除洗脫液。5)用聚丙烯酰胺凝膠電泳確定ILY濃度,以已知濃度的BSA標準液作為參照。6)體外紅細胞溶血實驗檢測提純的ILY的活性,用熱滅活ILY作為對照。2.檢測ILY的藥理學特征用高于實驗濃度十倍到二十倍的ILY及熱滅活的ILY分別注射ihCD59小鼠,確定ILY的藥理學特性,檢測注射后不同組織中ILY的分布以及對動物體是否具有毒性。3.檢測膽固醇對ILY作用的影響方法同紅細胞溶血實驗,在反應體系中加入不同濃度的膽固醇(100ug/ml至1600ug/ml).(二)在生理狀態(tài)下ILY對靶細胞的清除1.生理狀態(tài)下ILY對免疫系統(tǒng)靶細胞的清除1)分離LckCre+ihCD59+小鼠的脾臟細胞并在體外進行ILY孵浴,用流式細胞術檢測ILY在體外對hCD59陽性細胞的殺傷效果。2)分別給予LckCre+ihCD59+小鼠、LckCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠單次或多次ILY尾靜脈注射(75ng/g小鼠體重),通過流式細胞術和免疫熒光染色檢測相應小鼠中T細胞、單核細胞和樹突狀細胞在外周循環(huán)系統(tǒng)、脾臟和胸腺中的清除效果。3)檢測高濃度ILY(150ng/g和300ng/g)對LckCre+ihCD59+小鼠、LyzCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠體內(nèi)靶細胞的清除。4)檢測單次ILY殺傷LckCre+ihCD59+小鼠、LyzCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠體內(nèi)靶細胞后,靶細胞在外周循環(huán)系統(tǒng)和脾臟中的恢復情況。5)檢測ILY對LyzCre+ihCD59+小鼠肝臟中巨噬細胞和枯否細胞的殺傷和細胞損傷后的修復。2.生理狀態(tài)下ILY對實質(zhì)器官中細胞的清除及細胞清除后再生的影響1)在不同小鼠系中檢測ILY對肝細胞和膽管上皮細胞的清除對AlbCre+ihCD59+小鼠(肝細胞和膽管上皮細胞均表達hCD59). Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠(肝細胞表達hCD59)和經(jīng)tamoxifen誘導過的Sox9Cre+ihCD59+小鼠(膽管上皮細胞表達hCD59)進行ILY尾靜脈注射,并測量小鼠血清中ALT和膽紅素變化。2)檢測肝細胞和膽管上皮細胞受損后的修復在ILY注射40h后收集小鼠肝臟,通過BrdU染色檢測各個小鼠系中肝細胞和膽管上皮細胞的增殖。3)利用ILY對小鼠肝細胞和膽管細胞的有效清除模擬了慢性損傷模型,對AlbCre+ ihCD59+小鼠、Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠和Sox9Cre ERT+ihCD59+小鼠分別進行了為期9天的多次ILY尾靜脈注射(150ng/g,每三天注射一次),在最后一次ILY注射48小時后收集各組小鼠器官,用免疫組化染色檢測肝細胞和膽管上皮細胞的增殖。(三)ILY/ihCD59介導的靶細胞清除在研究病理機制方面的應用1.免疫細胞清除與急性肝損傷1)清除DC細胞對α-GalCer誘導急性肝損傷的影響對CD11cCre+ ihCD59+小鼠進行尾靜脈注射ILY或PBS,1小時后用a-Galcer誘導肝損傷。24小時后檢測血清中的細胞因子和ALT變化。2)清除T細胞、B細胞和髓系細胞對Con A誘導急性肝損傷的影響對LckCre+ ihCD59+小鼠,CD19Cre+ihCD59+小鼠,LyzCre+ihCD59+小鼠和ihCD59+小鼠進行尾靜脈注射ILY或PBS。3小時后用ConA誘導肝損傷。24小時后檢測血清中AST和ALT變化以及對肝臟進行HE染色。2.清除T細胞、B細胞和髓系細胞對實驗性自身免疫性腦脊髓炎的影響1)建立實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型(EAE)：用MOG免疫LckCre+ihCD59+小鼠,(:D19Cre+ihCD59+小鼠,LyzCre+ihCD59+小鼠和ihCD59+小鼠,誘導EAE發(fā)生。(2)ILY清除免疫細胞：免疫小鼠3天后開始對小鼠進行ILY注射,持續(xù)17天。每天觀察并記錄小鼠EAE發(fā)病的臨床分數(shù),免疫后第17天處死小鼠并觀察小鼠脊髓中MBP和神經(jīng)絲的變化。3.清除星形膠質(zhì)細胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復的影響(1)腦損傷模型：用立體定位系統(tǒng)對mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠造成腦損傷,并在損傷局部添加ILY處理殺傷膠質(zhì)細胞。在損傷后7天收集腦組織進行切片染色,檢測膠質(zhì)細胞的清除水平。(2)脊髓損傷模型：對mGFAP-Cre+ ihCD59+小鼠制造脊髓損傷,用明膠海綿在損傷局部添加ILY處理殺傷膠質(zhì)細胞。在術后觀察小鼠行動力的恢復情況,損傷后7天收集脊髓,檢測損傷區(qū)域膠質(zhì)細胞的清除情況。結果一、獲得了LoxP-Stop-LoxP-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠(ihCD59小鼠)通過將hCD59開放讀碼框插入CAG啟動子及兩端有LoxP位點的STOP終止元件(LSL)下游,得到pCAG-LSL-hCD59載體；利用體外實驗證實,轉(zhuǎn)染pCAG-LSL-hCD59載體的NIH3T3細胞僅在共轉(zhuǎn)染Cre重組酶表達載體的情況下,細胞膜表面有hCD59表達；通過Applied Stem Cell Inc公司的TARGATTTM定點敲入技術,把CAG-LSL-hCD59序列插入到FVB/NJ小鼠基因組的Hipp11(H11)位點,獲得Cre誘導性表達的Lox-Stop-Lox-hCD59轉(zhuǎn)基因小鼠(Cre inducible hCD59 mice, ihCD59小鼠)。在獲得的23只子代小鼠中,通過PCR方法驗證hCD59是否整合入小鼠的基因組DNA中。檢測后共得到了一只ihCD59雌性小鼠和一只ihCD59雄性小鼠。值得說明的是,ihCD59小鼠為+/+純合子小鼠。二、獲得系統(tǒng)和多種細胞特異性表達Cre和hCD59的雙轉(zhuǎn)基因小鼠(Cre+ihCD59+小鼠)(一)獲得系統(tǒng)表達hCD59的月eox2Cre+ihCD59+小鼠通過將ihCD59小鼠和系統(tǒng)表達Cre重組酶的Meox2Cre+小鼠雜交,并對子代小鼠進行基因鑒定,得到有hCD59表達的Meox2Cre+ ihCD59+、鼠和沒有hCD59表達的Meox2Cre-ihCD59+小鼠(雙轉(zhuǎn)基因小鼠中的+代表+/-雜合子)。通過流式細胞分析術和免疫組織化學染色,發(fā)現(xiàn)hCD59在Meox2Cre+ ihCD59+小鼠的所有器官均有表達,而未表達于Meox2Cre-ihCD59+鼠和C57BL/6野生型小鼠中。說明通過ihCD59小鼠和Cre陽性小鼠雜交來獲得hCD59表達陽性的子代小鼠是可行的；hCD59小鼠的誘導性hCD59表達在各個器官中非常均一。同時,hCD59在子代小鼠體內(nèi)的表達嚴格受到Cre的調(diào)控。(二)獲得多種細胞特異性表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠1.獲得T細胞、髓系細胞和樹突狀細胞特異表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠通過將ihCD59小鼠分別與LckCre+小鼠、LyzCre+小鼠和(D11cCre+小鼠雜交,并對子代小鼠進行基因鑒定,使hCD59特異表達在：LckCre+ihCD59+小鼠的T細胞、LyzCre+ihCD59+小鼠的髓系細胞和CD11cCre+ihCD59+小鼠的樹突狀細胞中。通過流式細胞術發(fā)現(xiàn)hCD59僅在LckCre+ihCD59+小鼠的T細胞、LyzCre+ihCD59+小鼠的髓系細胞(如單核細胞和中性粒細胞)以及CD11cCre+ihCD59+小鼠的樹突狀細胞中特異表達。2.獲得肝臟細胞和膽管上皮細胞特異表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠系用ihCD59小鼠和Albcre+小鼠雜交,在子代獲得hCD59在肝細胞和膽管上皮細胞同時表達的AlbCre+CD59+小鼠；用Alb啟動子調(diào)控的腺病毒表達載體Ad-AlbCre感染ihCD59小鼠,得到Ad-AlbCre+ihCD59小鼠；用ihCD59、鼠和Sox9CreERT+小鼠雜交,并通過對子代Sox9CreERT+ihCD59+小鼠進行tamoxifen誘導,使hCD59在子代小鼠的膽管上皮細胞中表達。免疫熒光染色表明hCD59僅在AlbCre+ihCD59+小鼠的肝細胞和膽管上皮細胞中表達；在Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠的肝細胞表達;在sox9CreERT+ihCD59+小鼠的膽管上皮細胞表達。3.獲得星形膠質(zhì)細胞特異表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠通過對mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠的腦冰凍切片進行GFAP和hCD59的免疫熒光共染色,我們發(fā)現(xiàn)hCD59只特異的表達在小鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞中。三、ILY/ihCD59介導的靶細胞清除方法在生理和病理條件下的應用(一)ILY的制備及活力測定和藥理學特性測定1.ILY的產(chǎn)出、純化及活性檢測：ILY在大腸桿菌中大量表達后,通過His親和柱純化,獲得純度高、不含內(nèi)毒素且具有活性的ILY。用熱滅活ILY和高于實驗劑量二十倍的ILY對ihCD59小鼠進行一次或多次注射,均未發(fā)現(xiàn)高劑量ILY對小鼠血常規(guī)指標和各個器官組織結構功能有任何影響。另外,發(fā)現(xiàn)在體外100ug/ml到1600ug/ml的外源膽固醇對ILY介導的細胞裂解無影響,為在高脂環(huán)境下應用ILY清除靶細胞奠定了基礎。(二)在生理狀態(tài)下ILY對靶細胞的清除1.生理狀態(tài)下ILY對免疫系統(tǒng)靶細胞的清除1)ILY在體外成功殺傷了LckCre+ihCD59+小鼠的脾臟細胞中hCD59陽性的T細胞,而沒有影響B(tài)細胞。2)對小鼠進行一次ILY尾靜脈注射可以分別有效清除LckCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠外周血中的T細胞和單核細胞。ILY還可以分別清除CD11cCre+ihCD59+小鼠脾臟中的樹突狀細胞和LckCre+ihCD59+小鼠脾臟中的T細胞。并且,ILY在體內(nèi)對hCD59陽性細胞的殺傷作用存在ILY劑量依賴性。提高注射的ILY濃度可以一定程度的增加靶細胞被清除的效果。3)檢測了各種免疫細胞被單次ILY注射殺傷后的恢復再生情況。結果顯示,LckCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠的外周血T細胞和單核細胞在ILY注射0.1小時后就可以被清除達90%,注射后24小時恢復到正常水平。同時發(fā)現(xiàn)單核細胞被清除后,Ly6C-細胞恢復的速度比Ly6C+細胞慢。LckCre+ihCD59+小鼠和CD11cCre+ihCD59+小鼠脾細胞中的T細胞和樹突狀細胞在ILY注射后24h也可恢復到正常水平。而對小鼠進行多次ILY注射可以將靶細胞水平長時間維持在較低的水平。4)ILY注射有效清除了L yzCre+ihCD59+小鼠肝臟局部F4/80陽性枯否細胞和巨噬細胞。BrdU標記顯示經(jīng)ILY殺傷后枯否細胞明顯發(fā)生增殖。我們對C57BL/6小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠進行GFP標記的單核細胞移植。在正常狀態(tài)下,移植后的C57BL/6小鼠肝臟中并不存在GFP陽性細胞。而經(jīng)過ILY注射的LyZCre+ihCD59+小鼠中,1.5%的枯否細胞表現(xiàn)為GFP陽性。說明在枯否細胞被急性清除狀態(tài)下,單核細胞參與了肝臟枯否細胞的再生。這一實驗也說明ihCD59模型是研究免疫細胞分化和再生的有效工具。2.生理狀態(tài)下ILY對實質(zhì)器官中細胞的清除及細胞再生的影響1)ILY對肝細胞和膽管上皮細胞的清除：在對AlbCre+ihCD59+小鼠(肝細胞和膽管上皮細胞均表達hCD59)、Ad-AlbCre+ihCD59小鼠(肝細胞表達hCD59)和經(jīng)tamoxifen誘導過的Sox9CreERT+ihhCD59+小鼠(膽管上皮細胞表達hCD59)進行ILY注射后,我們通過免疫染色發(fā)現(xiàn)ILY注射可以引發(fā)AlbCre+ihCD59+小鼠體內(nèi)顯著的肝組織損傷和膽管損傷。同時,肝損傷的程度呈現(xiàn)ILY濃度依賴性。在Ad-AlbCre+ihCD59小鼠中,ILY注射僅會引發(fā)肝細胞損傷。對經(jīng)過tamoxife誘導的sox9CreERT+ihCD59+小鼠進行ILY注射會引起小鼠膽管損傷。2)肝細胞和膽管細胞的清除后再生：研究還發(fā)現(xiàn)ILY在AlbCre+ihCD59+小鼠引起肝細胞和膽管上皮細胞損傷40小時后,可以檢測到肝臟有明顯的肝細胞和心管上皮細胞的增殖。但是在Ad-AlbCre+ihCD59+小鼠中特異清除肝細胞40小時后僅能檢測到肝細胞增殖；而在Sox9CreERT+ihCD59+小鼠特異清除膽管上皮細胞后則可以檢測到肝細胞和膽管上皮細胞均有增殖。同時,我們還對AlbCre+ihCD59+小鼠進行多次ILY注射。發(fā)現(xiàn)慢性肝細胞和膽管上皮細胞損傷引發(fā)了肝臟纖維化,在纖維化部位還檢測到了肝臟祖細胞。但是只損傷肝細胞或者膽管上皮細胞則不會引起纖維化和肝臟祖細胞產(chǎn)生。(三)ILY/ihCD59介導的靶細胞清除在多種疾病模型中的應用1.清除T細胞、B細胞和髓系細胞對急性肝損傷的影響1)利用α-Galcer誘導的肝損傷模型：我們發(fā)現(xiàn)在CD11icCre+ihCD59+小鼠中用ILY清除樹突細胞可以顯著緩解α-Galcer誘導的NKT細胞引發(fā)的急性肝損傷。2)利用Con A誘導的肝損傷模型：我們發(fā)現(xiàn)在LcCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠中,ILY介導的T細胞和單核細胞清除都可以緩解甚至阻止ConA誘導的急性肝損傷。但是在CD19Cre+ihCD59+小鼠中清除B細胞則沒有對ConA誘導的急性肝損傷產(chǎn)生影響。2.清除T細胞、B細胞和髓系細胞對實驗性自身免疫性腦脊髓炎的影響采用EAE來驗證ihCD59模型是否適用于研究慢性免疫性疾病中各免疫細胞的功能。實驗結果顯示,用ILY在LckCre+ihCD59+小鼠和LyzCre+ihCD59+小鼠中分別清除T細胞和單核細胞可以顯著抑制小鼠髓鞘受損程度,緩解EAE的發(fā)生,而在在CD19Cre+ihCD59+、鼠中清除B細胞則對疾病發(fā)生沒有明顯作用。3.清除星形膠質(zhì)細胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復的影響1)利用腦損傷模型,我們發(fā)現(xiàn)在mGFAP-Cre+ihCD59+小鼠的腦損傷部位局部注射ILY可以清除損傷活化的星形膠質(zhì)細胞,而尾靜脈注射ILY對星形膠質(zhì)細胞的清除效果有限。2)利用脊髓損傷模型,我們發(fā)現(xiàn)在,nGFAP-Cre+ihCD59+小鼠的脊髓損傷局部施加ILY處理也起到了消除反應性星形膠質(zhì)細胞的作用。星形膠質(zhì)細胞被清除的小鼠存在體重下降和活動能力恢復緩慢的現(xiàn)象。結論1.ihCD59/ILY介導的細胞清除方法可以特異、快速地清除體內(nèi)靶細胞本研究成功建立了Cre條件性表達hCD59的轉(zhuǎn)基因小鼠(ihCD59小鼠),通過與不同品系的細胞特異性Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,使hCD59特異表達在子代小鼠的靶細胞中。對子代小鼠進行ILY注射可以實現(xiàn)對靶細胞的體內(nèi)清除。肝臟細胞和膽管上皮細胞清除模型實驗顯示,ILY可以特異的在短時間內(nèi)分別清除肝細胞和膽管細胞,而沒有引起任何非目標效應。更重要的是,研究發(fā)現(xiàn)\LYIihCD59介導的細胞清除存在ILY劑量依賴性。2. ihCD59/ILY介導的細胞清除方法可以被用于研究不同細胞在生理和疾病狀態(tài)下的功能ILY單次注射和多次注射可以引起短期的和長期的靶細胞清除,成為研究細胞再生以及細胞在急性疾病模型(如急性肝損傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)局部創(chuàng)傷)或慢性病理過程(如EAE)中功能的有力手段。3.ILY具有很大的使用劑量范圍我們的實驗表明比清除細胞的劑量高十到二十倍劑量的ILY對小鼠都是安全有效的,不會引起任何非靶細胞殺傷效應,對實驗生物體也不存在毒副作用。創(chuàng)新性和意義本研究成功利用ILY和hCD59之間特異的相互作用,結合Cre重組技術實現(xiàn)了可誘導性的對多種細胞進行體內(nèi)清除。與現(xiàn)存的其他細胞清除模型相比,ILY/ihCD59介導的細胞清除具有以下優(yōu)點：1.ILY介導的細胞殺傷更加迅速：ILY可以通過與hCD59特異結合,在數(shù)秒內(nèi)對細胞膜穿孔進而裂解細胞,實現(xiàn)對靶細胞的清除。2. ILY/ihCD59介導的細胞清除特異性更強：ILY只會結合hCD59,殺傷表達hCD59的細胞,而不會結合除人類之外其它生物的hCD59分子。因此,即使大量提高ILY的使用劑量也不會對其他非hCD59表達細胞產(chǎn)生影響。3.ILY具有很寬的藥理學安全窗口：基于ILY裂解細胞的特異性高,比有效清除靶細胞的劑量高十到二十倍劑量的ILY對實驗動物都是安全的,不會引起任何非靶細胞殺傷效應,對實驗生物體本身不具有任何毒副作用。4.ILY介導的體內(nèi)細胞殺傷具有明顯的濃度依賴性：不同劑量的ILY可以引起不同程度的hCD59陽性靶細胞殺傷,這使ILY/ihCD59介導的細胞清除方法可以被用于需要不同程度清除細胞的研究。5.ILY的處理實施方便：在實驗中,通過尾靜脈注射、腹腔注射、皮下注射和局部作用等方法對實驗動物進行ILY給藥,都可以發(fā)揮很好的細胞殺傷作用。ILY的給藥方式取決于靶細胞存在部位及狀態(tài),選擇靈活。研究局限性ILY作為一個小分子蛋白質(zhì),在生物體內(nèi)的擴散有限,在一定程度上受到體內(nèi)屏障系統(tǒng)的限制。我們的研究結果顯示ILY可以更有效的殺傷絕大部分外周血中的細胞,清除部分實質(zhì)器官中的細胞,而對胸腺,骨髓和和中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞殺傷效果有限。目的動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是脂質(zhì)代謝異常誘導的血管壁的慢性炎癥,是多種心血管疾病(如,冠脈綜合征和腦中風)的病理基礎,嚴重危害人類的健康。已知多種免疫細胞,特別是巨噬細胞在AS斑塊的發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用。在動脈粥樣硬化的早期,血液中的脂質(zhì)成分通過受損的內(nèi)皮細胞進入血管壁,進而誘發(fā)血液中的單核細胞遷入血管壁,活化成為為巨噬細胞,吞噬和清除脂質(zhì),以減少斑塊的形成。隨著病程的進展,如果脂質(zhì)過多,過度荷脂的巨噬細胞會變成泡沫細胞,釋放大量的炎性細胞因子和生長因子,促進斑塊的發(fā)展和不穩(wěn)定性斑塊的形成,因此,抑制泡沫巨噬細胞的形成對減少斑塊的大小和改進斑塊的穩(wěn)定性有重要價值。新近研究提示細胞自穩(wěn)或死亡的新形式-自噬(utophagy)調(diào)控巨噬細胞的功能、影響斑塊的不穩(wěn)定性。自噬是真核生物進化中高度保守的對細胞內(nèi)物質(zhì)進行降解再利用的過程。細胞內(nèi)的可溶性分子(異常折疊的蛋白和脂質(zhì))和受損老化的細胞器都可以被包裹進入囊泡,這種囊泡被稱為自噬體。自噬體與溶酶體結合形成自噬溶酶體,利用溶酶體中的水解酶將自噬體包裹的物質(zhì)分解,幫助細胞達到生存產(chǎn)物的合成、降解以循環(huán)利用間的平衡。已知自噬參入動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和發(fā)展,特別是發(fā)現(xiàn)基礎的的巨噬細胞的自噬可抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展,巨噬細胞可通過脂自噬促進脂滴的降解,促進膽固醇外排,從而抑制泡沫巨噬細胞的形成,抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。故自噬已經(jīng)成為抗動脈粥樣硬化藥物研發(fā)的新靶點并已有相關藥物進入臨床。因此尋找能通過調(diào)控自噬水平的制劑,有可能成為新的抗動脈粥樣硬化的藥物。3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)是磷脂酰肌醇3磷酸激酶(PI3K)的抑制劑,由于它在饑餓時能通過抑制III型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(Class ⅢP13K)的活性而抑制自噬,故在體外常作為自噬的抑制劑被廣泛使用。但有研究顯示,在營養(yǎng)豐富的條件下,3-MA的長時間作用,也可以抑制I型磷脂酰肌醇三磷酸(Class IPI3 K)促進細胞發(fā)生自噬。研究結果表明,3-MA在體內(nèi)通過抑制自噬減輕了大鼠實驗性自身免疫神經(jīng)炎的發(fā)病及控制腸道病毒71的感染和疾病發(fā)生。3-MA對高脂誘導的動脈粥樣硬化有何影響?是通過抑制自噬還是促進自噬發(fā)揮作用,尚不清楚。故本選用3-MA和另一種自噬抑制劑LY294002對動脈粥樣硬化進行了干預,具體的研究的目的是：一、研究小鼠體內(nèi)3-MA應用對高脂誘導的動脈粥樣硬化的影響；二、探索3-MA影響動脈粥樣硬化形成和發(fā)展的可能機制(抑制自噬或促進自噬或有其他作用)方法一、研究3-MA在動脈粥樣硬化中的作用(一)動脈粥樣硬化斑塊的誘導和3-MA干預1.第一次干預治療實驗：將18只8周齡ApoE-/-小鼠隨機分成三組,每組6只小鼠：1)3-MA干預組(30mg/kg, Sigma,依據(jù)文獻[31])；同時以另一種自噬的抑制劑LY294002作為干預對照組(0.3mg/kg, Sigma,依據(jù)文獻[32])；PBS對照組小鼠。2)通過腹腔注射對小鼠進行相應的干預治療,每周兩次,共進行8周。3)最后一次注射結束后一周對小鼠進行解剖,收集心臟和主動脈。2.第二次干預治療實驗：根據(jù)第一次干預治療的結果將18只8周齡ApoE-/-小鼠隨機分為兩組：3-MA治療組(10只)和PBS對照組(8只),按照第一次治療的方式重復實驗。(二)檢測3-MA對動脈粥樣硬化斑塊形成和發(fā)展的影響1.收集所有小鼠的主動脈,將主動脈的內(nèi)壁充分暴露后進行油紅O染色,分析陽性染色的主動脈斑塊占主動脈總面積的比例。2.取小鼠主動脈根部制作成厚度為7um的連續(xù)冰凍切片,通過HE染色和油紅O染色分析主動脈根部斑塊的大小和脂質(zhì)成分比例。3.通過對主動脈根部冰凍切片進行CD3、Moma-2、smc免疫組化染色和天狼星紅染色檢測斑塊中的炎性細胞浸潤情況和斑塊組成。4.通過TUNEL染色檢測斑塊中的凋亡細胞。5.通過公式計算小鼠的斑塊易損因子。二、研究3-MA抑制動脈粥樣硬化形成和發(fā)展的可能機制(一)檢測3-MA在高脂環(huán)境對自噬的影響1.在體外,為了模擬體內(nèi)動脈粥樣硬化發(fā)生的過程,我們的對小鼠腹腔分離的巨噬細胞添加ox-LDL刺激。在添加ox-LDL刺激的同時,我們將細胞分為三個實驗組：ox-LDL單獨刺激組,3-MA預處理30分鐘后添加ox-LDL刺激組,雷帕霉素(Rap)預處理30分鐘后添加ox-LDL聯(lián)合刺激組。在各組添加刺激后的24、48和72小時分別收集細胞,提取細胞蛋白進行Western blot檢測自噬標記蛋白LC3和p62的表達水平。2.對小鼠主動脈根部的冰凍切片進行LC3免疫熒光染色,檢測斑塊中的自噬水平。(二)檢測3-MA對巨噬細胞泡沫化和存活的影響1.用小鼠主動脈根部的冰凍切片進行脂滴和LC3免疫熒光共染,分析斑塊中脂質(zhì)成分和自噬體分布的關系。2.在體外,將小鼠腹腔巨噬細胞分成兩個實驗組：ox-LDL單獨刺激組,3-MA預處理30分鐘后添加ox-LDL刺激組。在各組添加刺激后的24、48和72小時分別對各組細胞進行油紅O染色,統(tǒng)計油紅O染色為陽性的泡沫細胞占總細胞數(shù)量的比例。3.在體外,將小鼠腹腔巨噬細胞分成兩個實驗組：ox-LDL單獨刺激組,3-MA預處理30分鐘后添加ox-LDL刺激組、Rap預處理30分鐘后添加ox-LDL刺激組。用CCK-8檢測各組添加刺激后的24、48和72小時的細胞存活率。(三)檢測3-MA對斑塊局部細胞因子的影響提取小鼠主動脈的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行real-time PCR,檢測主要炎性和抑炎性細胞因子的表達情況,包括IL-17、IFN-yγ、IL-6、 TGF-(3、IL-10、IL-35的亞基IL-12αr和Ebi3及其相關亞基IL-1213和p28。還檢測了Treg細胞的標志Foxp3的表達。結果一、研究3-MA抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成并促進了斑塊的穩(wěn)定性,但另一個自噬抑制劑LY294002無作用(一)3-MA抑制了動脈粥樣硬化的形成1.由于3-MA的水溶性差,常規(guī)體外實驗采用DMSO溶解。為了克服DMSO的毒副作用,本研究采用PBS加熱溶解3-MA的方法,制備了低濃度水溶性3-MA,實驗證明這種水溶性3-MA不僅不損傷肝腎功能,還降低了小鼠血清中的AST水平。2.通過主動脈大體的油紅O染色,我們發(fā)現(xiàn)3-MA處理組小鼠主動脈中的動脈粥樣硬化斑塊顯著少于PBS對照組小鼠,但LY294002處理組小鼠與對照組比較無明顯差異。3.對主動脈根部冰凍切片進行HE染色表明,與PBS對照組小鼠對比,3-MA處理組小鼠主動脈根部的動脈粥樣硬化斑塊面積明顯減小。但LY294002處理組小鼠與對照組無明顯差異。4.對主動脈根部冰凍切片進行油紅O染色顯示,3-MA處理組小鼠主動脈根部斑塊中脂質(zhì)成分明顯低于對照組,但LY294002作用不明顯。(二)3-MA對動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性具有促進作用1.通過對主動脈根部進行相應的免疫組化染色我們發(fā)現(xiàn),3-MA對T細胞浸潤沒有顯著影響,但是明顯降低了巨噬細胞在斑塊中的比例,對斑塊中平滑肌細胞的比例也有一定程度的減少。天狼猩紅染色顯示3-MA處理組小鼠斑塊局部的膠原成分高于PBS對照組。TUNEL染色顯示3-MA處理顯著減少了小鼠斑塊中的凋亡細胞數(shù)量和壞死核心面積。2.通過計算和統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)3-MA處理組小鼠的斑塊易損因子明顯低于PBS對照組小鼠。但LY294002對斑塊穩(wěn)定性影響不大。二、研究3-MA抑制動脈粥樣硬化形成和發(fā)展的可能機制(一)體外3-MA長時間處理促進ox-LDL誘導的巨噬細胞自噬、減少泡沫胞形成并降低巨噬細胞活力體外實驗結果顯示用ox-LDL誘導腹腔巨噬細胞泡沫化的同時用3-MA長時間處理(24、48和72小時)會顯著增加自噬標志分子LC3的表達,同時作為自噬底物的p62分子會明顯降低,說明3-MA3-MA長時間處理可促進ox-LDL誘導的巨噬細胞自噬。同時,發(fā)現(xiàn)3-MA可抑制ox-LDL誘導的泡沫巨噬細胞的形成和減低泡沫巨噬細胞的活力。說明在高脂環(huán)境下,3-MA可通過促進自噬,促進減少泡沫巨噬細胞形成和促進自噬介導的細胞死亡。(二)3-MA干預顯著降低了脂滴成分小鼠體內(nèi)實驗顯示斑塊局部脂滴減少,殘留的自噬陽性的巨噬細胞減少。采用免疫熒光染色檢測小鼠主動脈斑塊中脂滴和LC3陽性自噬體的水平,發(fā)現(xiàn)3-MA處理組小鼠斑塊中自噬體少于PBS對照組小鼠。但是3-MA處理顯著降低了小鼠斑塊中的脂滴成分。同時我們發(fā)現(xiàn)脂滴主要積累在LC3染色陰性的區(qū)域,而自噬體較多的LC3陽性區(qū)域的脂滴明顯減少。提示我么自噬有助于脂質(zhì)的代謝排出。但是用Western blot檢測LC3在小鼠主動脈中的表達,發(fā)現(xiàn)3-MA處理組小鼠主動脈壁中的LC3在蛋白水平要低于PBS對照小鼠,同時I型P13K通路在3-MA處理組也低于PBS對照組。結合體外實驗,提示3-MA干預可能通過促進自噬有助于脂質(zhì)代謝,并且最終引起巨噬細胞的自噬性死亡和清除。(三)3-MA干預促進了炎癥抑制性因子表達Real-time PCR顯示3-MA促進了小鼠主動脈血管壁中的抑炎性細胞因子IL-10、 TGF-β口IL-35的表達,而對促炎性細胞因子IL-6、IL-17和IFN-γ的表達水平?jīng)]有明顯的影響�？紤]到調(diào)節(jié)性T細胞是主要的免疫負調(diào)控性細胞,我們也檢測了調(diào)節(jié)性T細胞的標志分子Foxp3的表達水平,發(fā)現(xiàn)3-MA處理組小鼠的Foxp3在轉(zhuǎn)錄水平明顯高于對照組小鼠,提示3-MA具有改善斑塊局部抗炎微環(huán)境的作用。結論一、3-MA對動脈粥樣硬化有顯著地抑制作用本研究證實3-MA顯著減小了高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠主動脈大體和根部的斑塊面積,并且顯著減少了斑塊中的脂質(zhì)成分。二、3-MA促進了動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性3-MA有效增加了動脈粥樣硬化斑塊纖維帽區(qū)域的平滑肌細胞,并且減少了斑塊中浸潤的巨噬細胞和壞死細胞。3-MA處理組小鼠的斑塊易損系數(shù)明顯低于對照小鼠。以上現(xiàn)象均表明3-MA顯著促進了動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。三、3-MA通過增強自噬水平,抑制巨噬細胞泡沫化并促進其死亡在高脂環(huán)境中,3-MA長時間處理促進了自噬的發(fā)生,從而有利于斑塊區(qū)域泡沫化細胞中的脂質(zhì)外排。3-MA還會影響高脂環(huán)境中巨噬細胞的存活率,在有效抑制細胞凋亡的狀態(tài)下,可能誘導巨噬細胞的自噬性死亡,從而導致斑塊中巨噬細胞的數(shù)量減少。四、3-MA可以促進斑塊局部抗炎性細胞因子的表達3-MA在體內(nèi)可以提高抗炎性細胞因子的水平,包括IL-10、TGF-β和IL-35,同時對Foxp3的表達水平也有促進,有助于維持斑塊局部的抗炎微環(huán)境。創(chuàng)新性和意義1.本實驗第一次在小鼠動脈粥樣硬化模型中研究了3-MA長期作用對動脈粥樣硬化的影響。2.本實驗確定了低濃度溶解于PBS中的3-MA對實驗動物不存在毒副作用,反而對高脂喂養(yǎng)的小鼠具有保護作用,使3-MA及其衍生物成為研發(fā)治療動脈粥樣硬化藥物的新靶點。研究局限性1.本實驗選用的LY294002并沒有對動脈粥樣硬化疾病的發(fā)展起到顯著作用,有可能是因為選用的體內(nèi)治療濃度不合適本次實驗。應選用不同濃度的LY294002和3-MA確定它們在體內(nèi)對動脈粥樣硬化的作用。2.鑒于自噬在動脈粥樣硬化發(fā)生早期和后期的活化水平和對細胞的影響可能不同,應該分階段研究3-MA在動脈粥樣硬化早期和后期的功能是否相同。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R543
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本文編號：1612094