發(fā)布時間：2018-03-10 05:12

  本文選題：體外心臟震波　切入點：動脈生成　出處：《昆明醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：[背景]冠心病(CHD)病死、病殘率極高,已成為全球公共衛(wèi)生領域的一大挑戰(zhàn)�，F(xiàn)有CHD常規(guī)療法各有其局限性,體外心臟震波治療(Cardiac shock wave therapy,CSWT)是新興的CHD無創(chuàng)治療方法。CSWT對心肌組織發(fā)放低能量震波,該物理能量可在心肌組織內產生剪切力和空穴效應,進而發(fā)揮其生物學效應。課題組前期臨床研究已初步驗證了 CSWT的有效性和安全性,相關動物研究表明CSWT有促豬缺血心肌動脈生成效應,而體外細胞實驗顯示CSWT可上調血管內皮細胞促動脈生成相關因子表達水平。但CSWT促動脈生成效應具體分子機制仍不清楚,有待進一步研究。此外,以燈盞花為代表的中藥在臨床廣泛用于心腦血管病,且療效明確,CSWT聯(lián)用中藥燈盞花治療冠心病是否具有協(xié)同作用值得探討。第一部分:CSWT對人心臟微血管內皮細胞的影響及其信號轉導機制的研究[目的]選取人心臟微血管內皮細胞(human cardiac microvascular endothelial cells,HCMEC)為研究對象,觀察CSWT對HCMEC促動脈生成相關因子eNOS、VEGF、MCP-1和ITGB1表達的影響。同時,觀察粘附性斑激酶抑制劑PF-573228和鈣敏感鉀通道阻斷劑Iberiotoxin對CSWT效應的影響以揭示CSWT顯效相關信號通路。此外,采用中藥燈盞花乙素(SCU)和CSWT聯(lián)合干預HCMEC探討二者是否具有協(xié)同效應。[方法]1.HCMEC細胞的復蘇、傳代培養(yǎng)以及穩(wěn)定細胞實驗平臺的建立。2.藥物干預 HCMEC細胞分為Control組、CSWT組、CSWT+FAK阻斷劑PF-573228 組、CSWT+KCa阻斷劑Iberiotoxin 組、CSWT+SCU50um 組、CSWT+SCU100um組、CSWT+SCU200um組。不同藥物刺激HCMEC細胞48h后收集細胞用于后續(xù)心臟振波治療。3.CSWT處理細胞每個實驗組加藥刺激48h后接受1次低能量體外震波治療(0.09mJ/mm2,200Times)。4.經CSWT處理的細胞培養(yǎng)24小時后,實時定量PCR檢測ITGB1、eNOS、VEGF、MCP1 的表達,western blot 實驗檢測 ITGB1、eNOS、VEGF、MCP1的表達,免疫組化檢測檢測ITGB1、eNOS、VEGF、MCPI的表達。[結果]1.與對照組相比,CSWT干預組VEGF、eNOS、MCP-1的mRNA表達均上調(4.61±0.05倍,3.99±0.01倍,1.57±0.09倍),ITGB1的mRNA表達下調(0.54±0.14 倍),差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);VEGF、eNOS、MCP-1、ITGB1蛋白相對表達灰度比值均升高(0.43與0.35,0.63與0.50,0.76與0.54,0.68與 0.63)。2.與 CSWT 組相比,CSWT+PF-57328 組 VEGF、eNOS、ITGB1 的 mRNA表達均下調(0.62±0.10倍,0.40±0.02倍,0.98±0.03倍)且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),但 MCP-1 的 mRNA 表達卻上調(17.1±0.01);VEGF、eNOS、ITGB1蛋白相對表達灰度比值降低(0.29與0.43,0.37與0.63,0.54與0.63),而MCP-1蛋白相對表達灰度比值卻升高(1.05與0.76)。3.與 CSWT 組相比,CSWT+Iberiotoxin組VEGF、eNOS、ITGB1 的 mRNA 表達均下調(0.53±1.02倍,0.64±0.02倍,0.35±0.01倍)且差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),MCP-1的mRNA表達也下調(0.82±0.02)但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);VEGF、eNOS、MCP-1、ITGB1蛋白相對表達灰度比值均降低(0.30 與 0.43,0.30 與 0.63,0.48 與 0.76,0.54 與 0.63)。4.與CSWT組相比,CSWT+SCU50um組VEGF的mRNA表達上調(5.98±0.05 倍),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而 eNOS、MCP-1、ITGB1 的mRNA 表達降低(0.29±0.02 倍,1.39±0.03 倍 0.39±0.01 倍);VEGF、eNOS蛋白相對表達灰度比值均升高(0.87與0.43,0.65與0.63,0.33與0.76),MCP-1、ITGB1蛋白相對表達灰度比值則降低(0.33與0.54,0.51與0.63)。5.與CSWT組相比,CSWT+SCU100um組VEGF的mRNA表達上調(5.29±0.31 倍),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而 eNOS、MCP-1、ITGB1 的mRNA 表達降低(0.27±0.04 倍,0.42±0.03 倍,0.,31 ±0.04 倍);VEGF、eNOS、MCP-1、ITGB1蛋白相對表達灰度比值均降低(0.03與0.35,0.13與0.50,0.31與 0.54,0.18與 0.63)。6.與CSWT組相比,CSWT+SCU200um組VEGF的mRNA表達上調(5.19±0.66 倍),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而 eNOS、MCP-1、ITGB1 的mRNA 表達降低(0.43±0.02 倍,0.86 ± 0.04,倍 0.,41±0.01 倍);VEGF、MCP-1、ITGB1蛋白相對表達灰度比值均降低(0.22與0.35,0.38與0.54,0.42與0.63),而eNOS蛋白相對表達灰度比值升高(0.87與0.50)。7.免疫組化檢測各組間eNOS、VEGF、MCP1表達量無顯著差異。[結論]1.CSWT可活化HCMEC上調eNOS,VEGF和MCP-1的表達水平,從而產生促動脈生成效應;2.KCa和整合素-FAK信號軸可能參與了 CSWT誘導HCMEC表達eNOS和VEGF的機械信號轉導過程;KCa可能作為機械感受器參與了 CSWT誘導HCMEC表達MCP-1的信號轉導過程,但整合素-FAK信號軸可能不是該信號轉導通路的一部分。3.CSWT聯(lián)合SCU干預HCMEC具有上調eNOS和VEGF表達水平的協(xié)同作用,該協(xié)同作用在SCU中低劑量組更為明顯。第二部分:CSWT對心肌梗死SD大鼠促動脈生成效應及其信號轉導機制的研究[目的]選取人SD大鼠為研究對象,探討CSWT對SD大鼠促動脈生成相關的eNOS、VEGF、MCP-1和ITGB1表達的影響。同時,觀察粘附性斑激酶抑制劑PF-573228和鈣敏感鉀通道阻斷劑Iberiotoxin對CSWT效應的影響以揭示CSWT顯效相關信號通路。此外,采用中藥燈盞花乙素(SCU)和CSWT聯(lián)合干預SD大鼠探討二者是否具有協(xié)同效應。[方法]1.采用開胸結扎前降支法建立SD大鼠急性心肌梗死模型2.實驗大鼠分為Control組、CSWT組、CSWT+FAK 阻斷劑PF-573228 組、CSWT+KCa阻斷劑 Iberiotoxin 組、CSWT+SCU10mg/kg 組、CSWT+SCU30mg/kg 組、CSWT+SCU90mg/kg組。所有大鼠均以0.09mJ/mm2能量,按每周三次的頻率處理4周。3.完成CSWT刺激方案飼養(yǎng)1周后動物處死,取心肌組織標本進行實時定量 PCR 檢測 ITGB1、eNOS、VEGF、MCP1 的表達,western blot 實驗檢測 ITGB1、eNOS、VEGF、MCP1 的表達,免疫組化檢測檢測ITGB1、eNOS、VEGF、MCP1的表達。[結果]1.與對照組相比,CSWT治療組VEGF、MCP-1的mRNA表達均上調(1.62±0.26倍,1.18±0.06倍),但差異無統(tǒng)計學顯著性差異(P0.05),ITGB1的mRNA表達上調(2.58±0.05倍),差異有統(tǒng)計學意義(P0.001);而eNOS的mRNA表達則降低(0.96±0.03倍);VEGF、eNOS、ITGB1蛋白相對表達灰度比值降低(1.66與1.86,0.09與0.37,0.50與1.11),而MCP-1蛋白相對表達灰度比值升高(1.24與0.30)。2.與 CSWT 組相比,CSWT+PF-57328 組 VEGF、eNOS、ITGB1 的 mRNA表達均上調(2.09 ±0.06倍,2.50 士 0.07倍,2.28±0.02倍)但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),但 MCP-1 的 mRNA 表達卻下調 0.71±0.04);eNOS、MCP-1、ITGB1蛋白相對表達灰度比值升高(0.70與0.09,1.73與1.24,0.76與0.63),而VEGF蛋白相對表達灰度比值則降低(0.11與1.66,1.00與1.11)3.與 CSWT 組相比,CSWT+Iberiotoxin組VEGF、MCP-1 的 mRNA 表達均下降(1.58±0.11倍,0.449±0.02倍)但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),eNOS、ITGB1的mRNA表達則升高(1.17 土0.02,2.16土0.01)但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);VEGF、ITGB1蛋白相對表達灰度比值降低(0.77與1.66,0.84與1.11),而eNOS、MCP-1蛋白相對表達灰度比值升高(0.27與0.09,1.59與0.24)。4.與 CSWT 組相比,CSWT+SCU1Omg/kg 組VEGF、eNOS、MCP-1、ITGB1的 mRNA 表達均升高(2.66±0.07 倍,2.29±0.03 倍,2.10±0.03 倍,2.79土0.02)但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);VEGF、eNOS蛋白相對表達灰度比值均升高(1.86與1.66,0.37與0.09),MCP-1蛋白相對表達量則降低(0.30與1.24),ITGB1蛋白相對表達量無變化(1.11與1.11)。5.與CSWT組相比,CSWT+SCU30mg/kg組VEGF的mRNA表達升高(3.03±0.13倍)差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),ITGB1的mRNA表達上調(5.08±0.13),差異有統(tǒng)計學意義(P0.001),而eNOS、MCP-1的mRNA表達降低(0.88±0.02 倍,1.01±0.05 倍);VEGF、eNOS、MCP-1 蛋白相對表達灰度比值均升高(1.97與1.66,0.87與0.37,1.45與1.24),ITGB1蛋白相對表達量稍降低(1.01與1.11)。6.與 CSWT 組相比,CSWT+SCU90mg/kg 組VEGF、ITGB1 的 mRNA 表達上調(5.19±0.66倍,3.17±0.04倍),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而eNOS、MCP-1 的 mRNA 表達降低(0.43±0.02 倍,0.86±0.04 倍);VEGF、eNOS、MCP-1蛋白相對表達灰度比值均升高(2.02與1.66,0.92與0.09,1.70與1.24),ITGB1蛋白相對表達量稍降低(1.05與1.11)。[結論]1.CSWT干預心肌梗死后SD大鼠可上調MCP-1表達水平,但對eNOS和VEGF表達水平影響不顯著。2.尚無足夠的證據(jù)支持KCa和整合素-FAK信號軸是CSWT上調SD大鼠促動脈生成相關因子機械信號轉導通路的一部分。3.中藥SCU與CSWT聯(lián)合治療有促進急性心肌梗死SD大鼠動脈生成協(xié)同效應。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R541.4

【參考文獻】

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本文編號：1591905