本文選題：心肌組織工程　切入點：心梗　出處：《哈爾濱工業(yè)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：心肌組織工程為缺血性心臟疾病治療提供了新的治療策略。研究人員目前在體外已成功構(gòu)建了具有節(jié)律性收縮的再造心肌組織或工程化心肌組織(Engineered cardiac tissues,ECTs),在體內(nèi)心梗修復(fù)方面也取得顯著成效。然而,考慮到心肌組織本身的電生理特性,以往用于心肌組織構(gòu)建的支架材料難以為心肌細胞提供導(dǎo)電微環(huán)境,所構(gòu)建的ECTs仍缺乏天然心肌的收縮-興奮耦聯(lián)與電傳導(dǎo)特性。近年來,導(dǎo)電納米材料在電傳導(dǎo)特性的組織構(gòu)建研究中受到研究人員的高度關(guān)注,其中石墨烯已被證實在生物醫(yī)學(xué)尤其是組織工程研究中具有良好的應(yīng)用前景。此外,ECTs的體內(nèi)示蹤對于評價其對心梗治療效果及細胞行為至關(guān)重要。在諸多標(biāo)記手段中,氧化鐵納米粒(Iron Oxide Nanoparticles,IRONs)因其良好的生物相容性及易檢測等優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于體內(nèi)細胞移植及ECTs的示蹤中。但針對IRONs對心肌細胞微結(jié)構(gòu)及細胞活性影響,尤其是三維ECTs中閏盤的形成影響尚不明確。為此,本論文重點闡明IRONs對心肌細胞微結(jié)構(gòu)及細胞活性的影響,尤其是三維ECTs中閏盤形成的影響規(guī)律,并以氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)-明膠為材料,在明確其對棕色脂肪干細胞(Brown Adipose Derived Stem Cells,BADSCs)作用基礎(chǔ)上,研究GO-明膠水凝膠攜帶IRONs標(biāo)記的BADSCs在心梗心肌中的分布及分化影響規(guī)律,具體研究結(jié)果如下:(1)IRONs對心肌細胞微結(jié)構(gòu)及生物活性影響:共沉淀法制備IRONs,表面修飾巰基丁二酸(2,3-Dimercaptosuccinic Acid,DMSA)后制備DMSA-IRONs。通過組織學(xué)染色及western blotting等檢測,表明DMSA-IRONs對心肌細胞微結(jié)構(gòu)分布影響較小。同時,在心肌細胞活性影響方面,體外3,3-二氨基聯(lián)苯胺顏色反應(yīng)證明了DMSA-IRONs能夠發(fā)揮類似過氧化酶的活性降低活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平,DMSA-IRONs在H2O2處理的心肌細胞內(nèi)同樣清除了部分ROS,對心肌細胞起到了保護作用。(2)DMSA-IRONs對ECTs中閏盤結(jié)構(gòu)的影響:在基于膠原/Matrigel構(gòu)建的三維ECTs中,DMSA-IRONs標(biāo)記后,透射電鏡及普魯士藍染色顯示細胞對DMSA-IRONs的吸收與其在ECTs中的分布位置有關(guān),ECTs邊緣的細胞大量攝取DMSA-IRONs,而ECTs內(nèi)部細胞攝取較少,且內(nèi)吞的DMSA-IRONs分布于細胞質(zhì)及囊泡中。在閏盤結(jié)構(gòu)形成方面,通過免疫熒光及western blotting檢測,證實DMSA-IRONs促進ECTs中縫隙結(jié)構(gòu)的形成,降低粘著連接及橋粒的形成。(3)GO-明膠水凝膠對BADSCs向心肌細胞分化影響研究:制備含不同濃度GO的甲基丙烯酸酯明膠(GO-Gel MA)水凝膠,GO對水凝膠多孔狀結(jié)構(gòu)無明顯影響,但增加了水凝膠的電容性。通過結(jié)晶紫染色、MTT檢測等篩選出適合BADSCs粘附及細胞活性的GO-Gel MA水凝膠,同時GO的摻入未明顯影響B(tài)ADSCs的增殖,而免疫熒光染色、western blot檢測顯示,GO-Gel MA水凝膠明顯促進了BADSCs向心肌細胞的分化及電傳導(dǎo)相關(guān)蛋白connexin 43的極化分布及表達,并且誘導(dǎo)了ILK-Akt-Erk1/2細胞信號的表達。(4)GO-Gel MA水凝膠攜帶摻雜鋅的氧化鐵磁納米粒標(biāo)記的BADSCs進行的心梗治療研究:利用熱分解鐵前體物質(zhì)的方法制備摻雜鋅的磁納米粒,經(jīng)DMSA表面修飾制備形成具有良好分散能力的磁納米粒,其大小為4.8±0.6 nm。GO-Gel MA水凝膠攜帶磁納米粒標(biāo)記的BADSCs進行大鼠心梗模型注射,經(jīng)心臟超聲、MRI技術(shù)、組織學(xué)染色等表明,GO-Gel MA水凝膠促進了BADSCs在心梗區(qū)的存活、遷移及分化,并增加了心臟心室壁的厚度,改善了心臟的收縮功能。綜上,本研究首先明確DMSA-IRONs對心肌細胞微結(jié)構(gòu)及細胞活性的影響,證實DMSA-IRONs發(fā)揮類似過氧化物酶活性降低細胞內(nèi)ROS,對心肌細胞起到保護作用;利用三維ECTs研究模型,表明DMSA-IRONs的攝取促進縫隙連接的形成,降低心肌機械性能相關(guān)的粘著連接、橋粒斑蛋白表達。另外,在基于導(dǎo)電支架對BADSCs向心肌細胞分化規(guī)律與體內(nèi)心梗移植研究中,GO-Gel MA水凝膠增強BADSCs的伸展,促進向心肌細胞分化的同時,誘導(dǎo)電傳導(dǎo)相關(guān)蛋白connexin 43的表達及ILK-Akt-Erk1/2信號,同時GO-Gel MA水凝膠攜帶BADSCs顯著增強心臟功能。本研究對未來IRONs及GO的ECTs構(gòu)建、標(biāo)記及體內(nèi)移植應(yīng)用奠定了研究基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R542.22;R318.08
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本文編號：1590645