本文選題：Interleukin-24　切入點：基因轉染　出處：《山西醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：高血壓是導致心血管疾病高死亡率的重要因素,可以通過多種機制導致終末目標組織器官如心臟、腦組織、腎臟、肝臟和血管的損傷,降壓治療可以明顯的預防和降低心血管不良事件的發(fā)生,所以降壓治療有著重要的意義。高血壓各種復雜的病理生理機制有一個共同點就是活性氧的利用度增加,即氧化應激。活性氧在心血管系統(tǒng)中調控血管內皮功能,參與血管內皮炎癥、增殖、遷移、凋亡、血管生成等過程。活性氧產生增強,以及抗氧化系統(tǒng)作用功能的減弱,結果可導致血管內皮損傷和功能異常,這是導致與血管內皮作用關系密切的,如高血壓、動脈粥樣硬化等疾病的重要原因。對于血管內皮細胞損傷的治療和修復保護,目前有學者將其視為降壓治療的終點,和疾病發(fā)展轉歸的危險預測信號,所以,研究血管內皮細胞的損傷與保護對于疾病預測和療效觀察意義重大。有研究發(fā)現(xiàn)抗高血壓藥物可以導致腎臟、膀胱、心臟、腦和肝臟組織基因表達改變,除了既往明確與心血管疾病有關的基因以外,還包括16種未曾在心血管疾病中發(fā)現(xiàn)的基因表達改變,其中包括白介素24(IL-24)基因,組織蛋白酶Z(Cathepsin Z,Ctsz)基因等。這些差異表達基因可能是潛在的生物標志物,以及心血管疾病防治新靶點,可能為該領域相關疾病治療的發(fā)展提供有價值的信息。IL-24基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因,國內外很多研究已經證明它在多種腫瘤生長轉移過程中發(fā)揮治療作用。一系列發(fā)病分子機制在腫瘤和心血管是共同的,吸煙產生的有毒物質代謝和飲食中脂肪攝入量增加,都可以引起該兩種病理過程有關的共同發(fā)病分子機理——即氧化應激和細胞損傷。動脈粥樣硬化的發(fā)病可能源于損傷、感染所致的變異或轉換單一的動脈平滑肌細胞的祖增殖克隆,類似于目前最廣泛持有的致癌發(fā)生理論。細胞增殖相關的調節(jié)通路參與動脈粥樣斑塊進展,脈管的病理性狹窄與癌侵襲進展。細胞間粘附分子性狀改變可以參與到斑塊和血栓的形成,以及腫瘤擴散轉移等病理過程。結合蛋白酶表達的改變可以參與到溶栓治療,動脈粥樣硬化斑塊擴張和出血,以及惡性腫瘤的侵襲和轉移。鑒于二者發(fā)病機制的共同點,一些新型的治療策略可以同時針對心血管疾病和癌癥,即針對心血管疾病和癌癥的共同發(fā)病分子機制有著類似的治療策略,主要包括減弱氧化應激損傷、使用抗炎劑減少趨化因子,細胞活素和生長因子的細胞信號、抑制細胞增殖、抗血管生成以延緩動脈硬化和癌癥斑塊擴張浸潤轉移、使用放射治療等方面。考慮IL-24基因的生物學作用涉及到心血管疾病和癌癥新型治療策略的多個方面,我們推測其對高血壓等心血管疾病的發(fā)病分子機制也有潛在的治療作用,以及與高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切關系,以及與降壓藥物治療具有相關性。在細胞實驗部分,我們研究IL-24基因表達是否對氧化應激導致的內皮損傷具有保護作用及作用機制,通過利用脂質體介導外源性導入重組質粒p DC-316-IL-24至體外培養(yǎng)臍靜脈內皮細胞(HUVEC),轉染后24小時利用熒光顯微鏡觀察轉染效率,RT-PCR檢測目的基因表達情況,轉染成功后給予不同濃度過氧化氫損傷,利用增殖實驗觀察IL-24對較低濃度的過氧化氫導致的HUVEC異常增殖的影響作用;較高濃度過氧化氫損傷后,HUVEC細胞存活率的檢測利用細胞計數(shù)Kit-8(CCK-8)法來進行檢測,HUVEC細胞凋亡情況采用Annexin-V/PI聯(lián)合染色并流式細胞術檢測,凋亡相關Cleaved caspase-3的表達采用Western-blot方法檢測,流式細胞術及熒光探針標記法測定細胞內活性氧含量,western-blot方法檢測PI3K/PKB信號通路蛋白的表達,Real-time PCR和Western-blot檢測細胞中高血壓疾病相關因子Angiotensinogen(血管緊張素原)、endothelin-1(內皮素-1)、ATRAP(血管緊張素Ⅱ1型受體相關蛋白angiotensinⅡtype 1 receptor-associated protein)、PDGF(血小板源性生長因子)RNA和蛋白表達情況。同時,基于IL-24廣泛生物學活性的理論基礎,我們推論IL-24基因與心血管疾病可能有密切關聯(lián),且可能具有治療潛力。在本研究的動物實驗部分,我們研究IL-24表達水平變化與高血壓疾病血壓升高與降壓治療的關系。我們通過利用血管緊張素II微量滲透泵皮下埋植構建高血壓大鼠模型,造模成功后采用Real-time PCR和Western-blot方法檢測對照組和高血壓模型組IL-24基因表達水平;穩(wěn)定升壓后一周給予高血壓模型組大鼠依那普利及硝苯地平降壓治療,血壓穩(wěn)定下降后一周同法檢測IL-24基因含量;分析IL-24基因的表達情況與血壓升降變化之間的關系。研究結果表明,細胞實驗中IL-24可以明顯抑制低濃度H2O2導致的細胞異常增殖,降低細胞內ROS含量,下調細胞內活化Caspase-3水平,減少氧化應激所致HUVEC細胞損傷,從而提高細胞存活率,降低細胞早期和晚期凋亡比率,并可以下調H2O2刺激所致高血壓發(fā)病相關因子的表達,從而減少心血管疾病的發(fā)生。IL-24可能通過活化PI3K/PKB信號通路來發(fā)揮抗氧化作用,進而影響其下游的如NF-κB、AP-1等信號通路來調節(jié)血管內皮功能和心血管疾病并發(fā)癥的發(fā)生。動物實驗中高血壓模型大鼠器官組織IL-24表達明顯下降,降壓治療后表達升高,IL-24與高血壓疾病發(fā)生發(fā)展密切相關。綜上所述,IL-24基因可以抑制HUVEC的異常增殖,活化PI3K/PKB信號通路來發(fā)揮抗氧化作用,減弱H2O2導致的氧化應激,保護血管內皮細胞抵抗氧化損傷,下調細胞內活化Caspase-3表達,減少細胞凋亡而提高存活率。同時,IL-24可以下調血管損傷后產生增多的與心血管疾病發(fā)病有關基因的表達,減少心血管疾病的發(fā)生,此外,IL-24可能參與依那普利和硝苯地平降壓治療的分子機制,這些結果表明IL-24基因除了具有抑癌作用,可能對于高血壓也具有治療潛力,或能作為新的治療高血壓的靶點和分子通路中的關鍵基因,然而,IL-24如何參與降壓藥物治療過程的詳細機制尚需后續(xù)研究中進一步探討�？紤]到癌癥和心血管疾病的發(fā)病共通性和IL-24對ROS誘導致病過程的抑制作用,IL-24可能為ROS導致的各種心血管疾病提供基本的干預策略。第一部分IL-24基因對過氧化氫導致HUVEC氧化損傷的保護作用和機制研究目的:研究IL-24對H2O2所致HUVEC損傷的影響及作用機制,探討IL-24與心血管疾病的相關性。方法:人臍靜脈內皮細胞株在37℃CO2孵箱內正常培養(yǎng),貼壁生長狀態(tài)良好情況下進行實驗操作。細胞實驗部分分組:Ⅰ空白對照:細胞用高糖DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+青鏈霉素雙抗中正常培養(yǎng);ⅡH2O2損傷組:該組細胞分別給予0.10,0.30mmol/L作為較低、較高終濃度的H2O2;ⅢH2O2損傷+IL-24預保護組:H2O2損傷濃度同組Ⅱ,在損傷之前先進行轉染預保護,將重組質粒p DC316-h IL-24和Lipofectamine 2000 10μl混勻以進行轉染,重組質粒p DC316-h IL-24與脂質體比例(μg:μl=1:1);ⅣH2O2損傷+空質粒組:H2O2損傷濃度同組Ⅱ,空質粒p DC316與脂質體比例(μg:μl=1:1);ⅤIL-24組:重組質粒p DC316-h IL-24轉染同組Ⅲ;Ⅵ空質粒組:p DC316轉染方法同組Ⅳ。轉染后24小時基因轉染組熒光顯微鏡觀察轉染效率,利用RT-PCR方法確定轉染成功。利用劃痕實驗檢測IL-24對低濃度H2O2導致的異常增殖的抑制作用,細胞存活率采用CCK-8法檢測,活化caspase-3表達采用western-blot方法檢測,HUVEC細胞凋亡情況和細胞內ROS水平利用流式細胞術及熒光探針標記法測定,western-blot方法檢測PI3K/PKB信號通路蛋白的表達,Real-time PCR和Western-blot法檢測細胞內心血管疾病相關因子RNA水平和蛋白表達情況。結果:劃痕實驗表明IL-24可以明顯抑制低濃度H2O2導致的細胞異常增殖,H2O2組與H2O2+IL-24組相比較,兩組差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05;IL-24可降低細胞內ROS含量,H2O2損傷組ROS含量明顯高于其他組,與對照組和IL-24保護組相比較差異具有統(tǒng)計學意義,P0.001;IL-24保護細胞對抗氧化損傷,可以明顯減少細胞凋亡情況,下調細胞內caspase-3的活化水平,H2O2損傷組和IL-24保護組差異具有統(tǒng)計學意義,P0.001;H2O2損傷組細胞存活率最低,與對照組相比較差異明顯,P0.001,加入IL-24保護可以明顯減少氧化應激引起的細胞損傷死亡,細胞存活率明顯提高,H2O2組與H2O2+IL-24組相比較具有明顯統(tǒng)計學差異,P0.05;H2O2損傷引起的氧化應激,刺激PI3K/PKB信號通路活性增強來發(fā)揮抗氧化作用,與未干預對照組相比較,PI3K、PKB(Akt)蛋白均表達上調,差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05。IL-24保護組可以顯著的提高該信號通路蛋白的表達水平,且與H2O2損傷組相比較差異顯著,P0.001,從而進一步發(fā)揮抗氧化作用;IL-24還可下調H2O2刺激導致升高的心血管疾病相關因子Angiotensinogen、endothelin-1、ATRAP、PDGF的的表達,P0.001。結論:IL-24可以抑制HUVEC的異常增殖,保護細胞對抗氧化損傷和抗細胞凋亡,下調細胞內活化caspase-3蛋白表達水平,提高HUVEC細胞存活率。同時,IL-24可以下調血管損傷后產生增多的與心血管疾病發(fā)病有關基因的表達,減少心血管疾病的發(fā)生和抑制疾病進展。IL-24可能通過活化PI3K/PKB信號通路來發(fā)揮抗氧化作用,進而影響其下游的一些因子或信號通路來調節(jié)血管內皮功能和心血管疾病并發(fā)癥的發(fā)生�？紤]到癌癥和心血管疾病的發(fā)病共通性和IL-24對ROS誘導致病過程的抑制作用,IL-24基因可能為ROS導致的各種血管疾病提供基本的治療策略。第二部分IL-24與高血壓疾病發(fā)病及治療相關性的研究目的:探討IL-24基因與高血壓疾病發(fā)生發(fā)展和藥物降壓治療的相關性。方法:正常SD大鼠分為對照組(n=12)和高血壓模型組(n=36)。利用血管緊張素II微量滲透泵構建高血壓大鼠模型,按照微量滲透泵使用說明和大鼠體重計算微量滲透泵用藥量【500 ng/(kg·min)】,手術操作將含藥微量滲透泵置于大鼠腹部皮下,無菌縫合,觀察大鼠生存情況,每日觀察大鼠精神狀態(tài)及血壓升高情況。血壓升高后1周處死該組部分大鼠(n=12)和對照組大鼠(n=12),取大鼠心臟和腎臟組織,Real-time PCR和Western-blot檢測IL-24基因表達含量的變化。剩余高血壓大鼠分為繼續(xù)高血壓組(n=12)和高血壓治療組(n=12)兩組,治療組給予依那普利(劑量35mg/Kg/d)和硝苯地平(劑量30mg/Kg/d)藥物治療,血壓穩(wěn)定下降后處死大鼠,Real-time PCR和Western-blot檢測大鼠心臟和腎臟組織IL-24基因表達含量的變化。結果:Real-time PCR和Western-blot檢測大鼠高血壓造模成功和降壓治療后心臟和腎臟組織中IL-24基因的RNA和蛋白水平。結果表明,高血壓造模成功后,大鼠心臟和腎臟組織的IL-24基因表達明顯下調,與對照組相比較具有統(tǒng)計學差異,而降壓治療后,IL-24基因表達又會明顯升高,與未治療組比較具有明顯差異,P0.001。Western-blot結果表明,高血壓造模成功的大鼠體內IL-24蛋白表達明顯減少,與對照組相比較,與β-actin相比,IL-24蛋白相對表達含量分別為(0.95±0.041/1.87±0.062),P0.001,對照組大鼠與高血壓組大鼠相比較差異具有統(tǒng)計學意義。經過降壓治療后,IL-24基因RNA和蛋白表達明顯上調,與未治療組相比較,與β-actin相比,IL-24蛋白相對表達含量分別為(1.54±0.014/0.81±0.042),P0.001,降壓治療組和未治療組相比差異具有統(tǒng)計學意義,P0.001。結論:通過構建高血壓模型,證明IL-24基因RNA和蛋白表達與高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切相關性,血壓升高后該基因表達下降,降壓治療可出現(xiàn)該基因的表達升高,提示IL-24可能參與依那普利和硝苯地平降壓治療的分子機制,但是IL-24如何參與降壓藥物治療過程的詳細機制尚需后續(xù)研究中進一步探討。研究結果提示IL-24基因可能對于高血壓也具有治療潛力,或能作為新的治療高血壓的靶點和分子通路中的關鍵基因。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R544.1

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本文編號：1585726