本文關(guān)鍵詞： 低密度脂蛋白 氧化修飾 巨噬細胞 脂質(zhì)筏 非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)　出處：《武漢大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)是心血管系統(tǒng)最常見的疾病。氧化修飾的低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)在AS的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用。而且LDL一旦被氧化,無論被巨噬細胞攝取與否都會表現(xiàn)強烈AS效應(yīng),因此,動脈粥樣硬化的抗氧化研究勢在必行。在體外,LDL的氧化可以被多種抗氧化劑如維生素E和丙丁酚等所完全拮抗。但在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中存在大量的抗氧化劑的情況下,LDL仍被氧化。LDL在體內(nèi)可能是被細胞膜粘附在某個封閉的微環(huán)境中,從而避開環(huán)境中的抗氧化劑,這就使得臨床上抗氧化劑的效果不理想。在前期的實驗結(jié)果支持下,我們推測脂質(zhì)筏就是這樣的微環(huán)境。本論文主要以基于質(zhì)譜的非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)平臺,研究天然LDL不同時間點刺激下巨噬細胞脂質(zhì)筏中蛋白的變化情況,對LDL的氧化機制進行探討,本文的研究內(nèi)容主要包括以下三個方面：1.將LDL(100μg/ml)與巨噬細胞Raw264.7分別孵育5min,15min,30min。激光共聚焦檢測脂質(zhì)筏標志分子GM1的分布情況；熒光漂白恢復(fù)技術(shù)檢測脂質(zhì)筏的流動性；密度梯度離心分離巨噬細胞脂質(zhì)筏。實驗結(jié)果顯示：在靜息狀態(tài)下,脂質(zhì)筏的標志性分子GM1均勻的分布在細胞膜表面,加入LDL之后GM1逐漸聚集,初步證明LDL能夠促進巨噬細胞脂質(zhì)筏的形成；脂質(zhì)筏含有大量的膽固醇和長鏈飽和脂肪酸,因此其流動性比普通的細胞膜要差些,于是通過熒光漂白恢復(fù)技術(shù)我們也發(fā)現(xiàn)LDL刺激巨噬細胞以后,GM1熒光淬滅所需要的恢復(fù)時間也長一些,這就說明巨噬細胞在經(jīng)LDL刺激以后細胞膜的流動性降低,究其原因是LDL促進了巨噬細胞的脂質(zhì)筏的形成,使細胞膜的流動性降低。密度梯度離心分離巨噬細胞脂質(zhì)筏后,通過免疫印跡實驗檢測脂質(zhì)筏標志蛋白Flotillin-1,Caveolin-1的分布得知6-8層為脂質(zhì)筏,BCA法檢測LDL刺激前后脂質(zhì)筏蛋白含量變化,從圖2-4我們可以看出,在LDL刺激后,分離得到的脂質(zhì)筏中蛋白含量始終是高于未刺激組,正是由于LDL的刺激促進某些分子轉(zhuǎn)位進入到脂質(zhì)筏中。2.為了研究哪些分子在LDL的刺激下轉(zhuǎn)位進入脂質(zhì)筏中,采用非標記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對脂質(zhì)筏相關(guān)蛋白進行分析。利用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異蛋白進行GO條目富集分析以及蛋白相互作用分析。實驗結(jié)果顯示：我們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)筏相關(guān)蛋白呈現(xiàn)出4種變化模式：(1)180個蛋白在LDL不同時間點刺激下其在脂質(zhì)筏中的含量均上升；(2)63個蛋白含量在LDL刺激5分鐘或者15分鐘下調(diào),隨后又上升；結(jié)果見附表一；(3)147個蛋白在LDL不同時間點刺激下其在脂質(zhì)筏中的含量均下調(diào)；(4)48個蛋白的含量在LDL刺激5分鐘或者15分鐘上升,隨后又下調(diào)。涉及氧化還原、脂質(zhì)分解過程、白細胞粘附、跨膜轉(zhuǎn)運、白細胞趨化、脂質(zhì)堆積、內(nèi)吞、蛋白轉(zhuǎn)運、生物粘附、氧化應(yīng)激等過程顯著富集。而通過String數(shù)據(jù)庫分析,建立了差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,許多蛋白的相互作用引起我們高度關(guān)注,如ERp29與calreticulin。本章中對質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析為后面篩選與LDL氧化相關(guān)的蛋白奠定基礎(chǔ)。3.基于脂質(zhì)筏蛋白質(zhì)組學(xué)的LDL氧化相關(guān)因子的篩選及功能研究。從LDL粘附于巨噬細胞到酶的激活,并經(jīng)分泌找到LDL對其進行氧化,這之間的生物化學(xué)過程大致分為3個部分：(1)LDL的粘附,(2)信號傳導(dǎo),(3)酶的激活及定向分泌。我們按照以上3個生物化學(xué)過程篩選LDL氧化相關(guān)蛋白,最終確定ERp29作為目標分子。首先采用免疫印跡驗證質(zhì)譜數(shù)據(jù)的可靠性,再利用siRNA的方法探討ERp29與巨噬細胞介導(dǎo)的LDL氧化之間的關(guān)系。實驗結(jié)果顯示：用p-環(huán)糊精來破壞巨噬細胞脂質(zhì)筏結(jié)構(gòu)后,其氧化LDL的能力下降并且抑制了ERp29蛋白向脂質(zhì)筏的轉(zhuǎn)位,初步證明了脂質(zhì)筏對LDL的氧化以及ERp29蛋白的轉(zhuǎn)位是必須的,隨后,我們利用siRNA下調(diào)細胞內(nèi)ERp29的表達,圖4-3A顯示,siRNA干擾后的巨噬細胞的氧化LDL的能力下降,表現(xiàn)為TBARS值在細胞與LDL孵育24時明顯減少,進一步研究其機制發(fā)現(xiàn)ERp29能夠通過抑制Nox2向脂質(zhì)筏的轉(zhuǎn)位來影響NADPH酶的裝配從而降低細胞內(nèi)ROS水平,最終引起巨噬細胞介導(dǎo)LDL氧化能力的下降。
[Abstract]:鍔ㄨ剦綺ユ牱紜寲(Atherosclerosis, AS)鏄績琛，

本文編號：1544930