本文關(guān)鍵詞： 外周血 過度生長內(nèi)皮細(xì)胞 細(xì)胞表型 血管性血友病因子 血管性血友病 血管性血友病因子 VWF基因突變 血管性血友病 血管性血友病因子前導(dǎo)肽 VWF基因突變 VWF多聚化 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留　出處：《蘇州大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:與內(nèi)皮干細(xì)胞相比,外周血來源的過度生長內(nèi)皮細(xì)胞(blood outgrowth endothelial cells,BOECs)富含血管新生和細(xì)胞黏附所需的蛋白,生物學(xué)特性更像內(nèi)皮細(xì)胞。同時它克服了成熟的人臍血內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增量少和表型易發(fā)生改變的缺點,成為研究血管異常相關(guān)性疾病的新工具。本研究旨在建立從人外周血中體外培養(yǎng)、擴(kuò)增BOECs,并進(jìn)行鑒定的方法。方法:采集健康供者外周血,梯度離心獲得單個核細(xì)胞,接種于膠原鋪板的細(xì)胞培養(yǎng)皿上,EGM-2完全培養(yǎng)基培養(yǎng)4周。觀察BOECs細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面抗原表達(dá)。分析BOECs細(xì)胞上清血管性血友病因子(von Willebrand factor,VWF)多聚體分布,免疫熒光共聚焦鑒定細(xì)胞內(nèi)VWF的貯存及VWF的刺激分泌。結(jié)果:體外誘導(dǎo)培養(yǎng)4周左右,出現(xiàn)克隆性生長的細(xì)胞集落,BOECs呈現(xiàn)“鋪路石”樣外觀。經(jīng)過3周左右的擴(kuò)增后,過度生長的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)CD31、CD34、EPCR陽性,CD14、CD45、CD133表達(dá)陰性。收集BOECs細(xì)胞上清,進(jìn)行VWF多聚體分析,與正常血漿相比VWF多聚體分布無差異。在熒光共聚焦顯微鏡下,BOECs細(xì)胞內(nèi)貯存VWF,加入佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)刺激后,細(xì)胞內(nèi)VWF增加,細(xì)胞表面可見VWF絲狀結(jié)構(gòu)。結(jié)論:運用本實驗方法我們在國內(nèi)首次實現(xiàn)了人BOECs的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定。該方法可以為血管性血友病(von Willebrand disease,VWD)發(fā)病機(jī)制的探討提供天然的細(xì)胞模型,并可能為病人基因治療提供新工具。目的:血管性血友病因子質(zhì)或量的異常導(dǎo)致人類最常見的遺傳性出血性疾病,即血管性血友病。國際血栓和止血協(xié)會建立的VWD數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)登記了許多VWF基因突變,但是來自亞洲尤其是我國的資料較少。中國VWD患者VWF基因突變類型、基因型與診斷之間的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。方法:本文收集了38例VWD患者及其家庭成員的外周血標(biāo)本,對它們進(jìn)行VWF基因篩查,同時收集了患者的臨床資料及實驗室檢查結(jié)果。結(jié)果:采集的38個樣本中,1型VWD 12例,2A型6例,3型13例,臨床無出血癥狀的健康攜帶者7例。2A型VWD患者VWF:RCo/VWF:Ag明顯低于1型和3型VWD患者。1型VWD患者以雜合突變?yōu)橹?3型VWD以復(fù)合雜合突變?yōu)橹鳌９舶l(fā)現(xiàn)了30種VWF基因突變,包括錯義突變、無義突變、缺失和插入突變、剪接位點突變及復(fù)雜突變。其中20種是未報道過的新基因突變。結(jié)論:我們篩查了23個VWD患者家系,發(fā)現(xiàn)了20種新的VWF基因突變,擴(kuò)充了中國VWD患者基因數(shù)據(jù)庫。同時研究發(fā)現(xiàn)VWF基因突變有助于VWD的診斷和分型診斷。這些新的基因突變導(dǎo)致VWD的發(fā)病機(jī)制值得進(jìn)一步探討,并將為VWD患者的精準(zhǔn)醫(yī)療提供研究基礎(chǔ)。目的:血管性血友病因子前導(dǎo)肽(VWF propeptide,VWFpp)在VWF的多聚化、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運及分泌過程中非常重要,它由VWF的D1和D2區(qū)組成。盡管已經(jīng)報道了許多位于成熟VWF分子的基因突變,但是VWFpp突變的報道較少,而且其導(dǎo)致VWD發(fā)病的機(jī)制不甚明了。方法:我們瞬時轉(zhuǎn)染并表達(dá)了全長野生型和突變體VWF,分析VWF多聚體、VWF基礎(chǔ)和刺激分泌。用免疫熒光共聚焦顯微技術(shù)和western blotting法分析了VWF在細(xì)胞內(nèi)的定位。采用截短型VWF的二聚化模型進(jìn)一步研究了全長VWF多聚化障礙的原因。結(jié)果:我們在3個無關(guān)的血管性血友病患者中發(fā)現(xiàn)了3個新的基因突變(p.Gly39Arg,p.Lys157Glu,p.Cys379Gly)和1個已經(jīng)報道過的突變(p.Asp141Asn)。人胚胎腎293細(xì)胞系體外表達(dá)實驗顯示,4個突變均導(dǎo)致VWF多聚化障礙。與野生型D1D2D’D3片段比較,4個截短型突變體形成D’D3二聚體的量減少。突變體VWF的基礎(chǔ)分泌及佛波酯刺激的調(diào)節(jié)分泌均減少。免疫熒光共聚焦和western blotting的研究結(jié)果顯示突變體VWF滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。結(jié) 論:VWF D1區(qū)的錯義突變降低了VWFpp氧化還原酶活性,從而導(dǎo)致VWF多聚化障礙。突變體VWF滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,降低了VWF基礎(chǔ)分泌和刺激分泌,因而導(dǎo)致了攜帶這些基因突變的VWD患者的出血傾向。這將為今后前導(dǎo)肽突變的VWD患者精準(zhǔn)醫(yī)療提供治療靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R554.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1514280