本文關(guān)鍵詞： 心肌缺血再灌注損傷 IL-21 IL-21R MIRI IL-21 中性粒細(xì)胞 趨化因子 IL-21 信號通路 JAK-STAT PI3K/Akt MAPK NF-κB　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分 IL-21在小鼠心肌缺血再灌注損傷中的表達(dá)規(guī)律及作用目的：免疫系統(tǒng)激活在心肌缺血再灌注損傷(MIRI)中發(fā)揮的重要作用已得到廣泛證實(shí)。IL-21是一種多效性細(xì)胞因子,其在MIRI中的作用尚不明確。本部分實(shí)驗(yàn)旨在研究IL-21及其受體在小鼠MIRI中的表達(dá)規(guī)律,并探討IL-21對MIRI的作用。方法：通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支構(gòu)建小鼠MIRI模型,通過real-time PCR和western blot檢測缺血再灌注后不同時間點(diǎn)(30 min、1 h、6 h、12 h、24 h)心肌組織IL-21及受體特異鏈IL-21R的表達(dá)水平。為明確IL-21在MIRI中的作用,在再灌注前給予IL-21中和性抗體或重組小鼠IL-21對MIRI模型進(jìn)行預(yù)處理以阻斷或增強(qiáng)IL-21的效應(yīng),于再灌注1天時檢測MIRI相關(guān)各項(xiàng)指標(biāo)的改變,包括Even's blue/TTC雙染色法測定心肌梗死面積、血清肌鈣蛋白(TnT)檢測心肌損傷以及心臟超聲測定左室射血分?jǐn)?shù)(EF)和左室縮短分?jǐn)?shù)(FS)評價心功能。結(jié)果：與假手術(shù)組相比,再灌注后30 min小鼠心肌組織中IL-21 mRNA和蛋白表達(dá)均開始升高,并持續(xù)至再灌注后24 h。IL-21受體特異鏈IL-21R mRNA和蛋白表達(dá)均在再灌注后12h開始升高,并持續(xù)至24 h。與同型對照抗體組相比,中和IL-21的作用能夠縮小梗死面積、降低血清TnT水平及改善心功能。與之相反,外源性給予重組IL-21則明顯增加心肌梗死面積、升高血清cTnT水平,并使心功能損傷加重。結(jié)論：IL-21及其受體在小鼠MIRI后早期表達(dá)上調(diào);中和內(nèi)源性IL-21可減輕MIRI,而外源性IL-21干預(yù)則會加重MIRI。第二部分I L一21通過募集中性粒細(xì)胞浸潤參與心肌缺血再灌注損傷目的：以往研究表明,MIRI后大量中性粒細(xì)胞浸潤及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是加重MIRI的重要機(jī)制之一。本部分實(shí)驗(yàn)旨在探討IL-21是否影響MIRI后中性粒細(xì)胞浸潤,及其相關(guān)機(jī)制。方法：8-12周齡雄性C57B/L6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、MIRI對照組、MIRI外源性IL-21干預(yù)組,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)定量檢測再灌注3h后局部心肌組織中性粒浸潤的數(shù)目：Real-time PCR檢測心肌組織ELR+CXC趨化因子KC、MIP-2和LIX的表達(dá)。體外分離培養(yǎng)C57B/L6小鼠乳鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞,給予IL-21刺激后通過real-time PCR檢測KC和MIP-2 mRNA表達(dá),ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中KC和MIP-2的濃度。體外分離成年C57B/L6小鼠骨髓中性粒細(xì)胞,與有或無IL-21刺激的心肌細(xì)胞或心臟成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清分別置于transwell上、下小室中,檢測中性粒細(xì)胞遷移活性。結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)定量分析顯示,與假手術(shù)組相比,MIRI組小鼠心肌組織中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)目增加,而給予外源性IL-21干預(yù)進(jìn)一步增加了心肌組織中性粒細(xì)胞浸潤程度。給予外源性IL-21上調(diào)了再灌注后30 min和3h心肌組織KC、MIP-2 mRNA表達(dá),而不影響LIX表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)中,給予IL-21刺激1h后,心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞KC和MIP-2 mRNA表達(dá)均較對照組明顯升高；給予IL-21刺激24 h后,兩種細(xì)胞培養(yǎng)上清中KC、MIP-2濃度亦明顯升高。中性粒細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,IL-21刺激心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞后的條件培養(yǎng)上清能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞遷移。結(jié)論：IL-21可能通過上調(diào)心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞中趨化因子KC和MIP-2的表達(dá),促進(jìn)中性粒細(xì)胞遷移,進(jìn)而介導(dǎo)MIRI后心肌組織局部中性粒細(xì)胞浸潤。第三部分 IL-21促進(jìn)心肌缺血再灌注損傷和中性粒細(xì)胞浸潤的分子機(jī)制目的：以往研究表明,JAK-STAT(主要是STAT1和STAT3)、PI3K/Akt、ERK、p38 MAPK和NF--kB等信號通路參與了IL-21在不同細(xì)胞類型的不同生物學(xué)效應(yīng)；同時,上述信號通路也在MIRI的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本部分實(shí)驗(yàn)通過在組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)水平分別探討IL-21對上述信號通路激活的效應(yīng),以期闡明IL-21誘導(dǎo)心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞趨化因子表達(dá),促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤并介導(dǎo)心肌損傷的分子機(jī)制。方法：8-12周齡雄性C57B/L6小鼠構(gòu)建MIRI模型,取假手術(shù)組和MIRI再灌注不同時間點(diǎn)(10 min、30 min、60 min、120 min)心肌組織,western blot檢測ERK、p38 MAPK、 Akt、 NF-kB p65、 STAT1和STAT3通路激活的時間規(guī)律。構(gòu)建小鼠MIRI模型,分為對照組和IL-21干預(yù)組,分別于再灌注后10min、30min通過western blot檢測IL-21對各信號通路關(guān)鍵分子磷酸化程度的改變。離體分離培養(yǎng)小鼠乳鼠心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞,western blot檢測IL-21刺激不同時間點(diǎn)(10 min、30 min、60 min、120 min)各信號通路磷酸化改變。為進(jìn)一步明確IL-21處理后發(fā)生激活的信號通路是否為調(diào)控趨化因子表達(dá)的信號機(jī)制,于IL-21刺激兩種細(xì)胞前分別給予相應(yīng)信號通路阻滯劑預(yù)處理,real-time PCR和ELISA分別檢測KC、MIP-2mRNA表達(dá)和分泌的改變。結(jié)果：在小鼠MIRI模型中,再灌注10 min時ERK、p38 MAPK和NF-κB p65即開始激活,而Akt、STAT1和STAT3在再灌注30 min后開始激活。進(jìn)一步在再灌注10 min、30 min兩個時間點(diǎn)分別檢測在體IL-21干預(yù)對各信號通路激活的影響。結(jié)果顯示,再灌注10 min時,IL-21增強(qiáng)了p38 MAPK的激活效應(yīng)；再灌注30 min時,IL-21可同時激活p38 MAPK和NF-κB信號通路。然而,IL-21對其他信號通路關(guān)鍵分子并無明顯激活效應(yīng)。細(xì)胞水平上,心肌細(xì)胞在IL-21刺激10-30 min時表現(xiàn)為Akt激活,NF-κB p65是其下游信號分子,于30 min開始激活并持續(xù)至2 h。心臟成纖維細(xì)胞p38MAPK通路在IL-21刺激30 min后開始激活,而NF-κB p65于1h后開始激活。此外,IL-21處理心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞后ERK、STAT1或STAT3通路均未見激活。在IL-21刺激前,心肌細(xì)胞給予PI3K/Akt阻滯劑或NF-κB阻滯劑預(yù)處理可顯著抑制KC、MIP-2mRNA表達(dá),其分泌被部分抑制。相似地,心臟成纖維細(xì)胞給予p38 MAPK阻滯劑或NF-κB阻滯劑預(yù)處理同樣可顯著抑制KC、MIP-2mRNA表達(dá)和分泌。結(jié)論：心肌細(xì)胞Akt/NF-κB信號通路和心臟成纖維細(xì)胞p38 MAPK/NF-κB信號通路的激活是IL-21誘導(dǎo)趨化因子KC、MIP-2表達(dá)上調(diào)的重要信號通路機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54

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