本文關鍵詞：TGR5對血管緊張素Ⅱ誘導乳小鼠心肌成纖維細胞增殖的影響及機制

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【摘要】：背景:隨著生活方式改變,心血管病的發(fā)病率呈逐年上漲趨勢。心室重構是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的必經之路,它是由多種損傷因素共同參與的結果,其中NF-κB介導的炎癥反應是重要一環(huán)。心臟組織是由心臟細胞及細胞外間質共同組成,在心室重構過程,心臟細胞中的心肌成纖維細胞起著重要作用。G蛋白偶聯(lián)受體(TGR5)作為一種膽汁酸膜受體,在多種組織、器官上均有表達,對機體的能量代謝、免疫調控等反應過程起著重要的作用。已有研究表明在單核-巨噬細胞[1,2]、膽道上皮細胞[3]、胃[4]等組織細胞膜上TGR5激動可減輕NF-κB介導的炎癥反應。但目前尚無相關研究明確TGR5激動對心肌成纖維細胞的影響。目的:探究G蛋白偶聯(lián)受體(TGR5)激動對血管緊張素II誘導的乳小鼠心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的影響,并探討可能存在的機制。方法:1、乳小鼠CFs的培養(yǎng)與鑒定:使用酶消化及差速貼壁法培養(yǎng)CFs,免疫熒光鑒定CFs。2、檢測TGR5 mRNA在乳小鼠CFs的表達量:使用RT-PCR法檢測CFs及心臟、肝臟、脾臟組織上TGR5mRNA表達量。3、TGR5過表達病毒制備與檢測。4、檢測TGR5病毒對CFs的感染效率:實驗設置為(1)實驗組:CFs-v+培養(yǎng)基組、CFs-v+Polybrene組、CFs-v+ENi.S組、CFs-v+Polybrene+ENi.S組(CFs-v指成功感染TGR5過表達病毒的CFs,“+”指陽性病毒,“-”指陰性病毒);(2)對照組:CFs+培養(yǎng)基組、CFs+Polybrene組、CFs+ENi.S組、CFs+Polybrene+ENi.S組。5、檢測TGR5過表達病毒感染后的CFs上TGR5 mRNA的表達情況:使用RT-PCR法檢測CFs、CFs-v(+)、心臟、肝臟、脾臟組織上TGR5 mRNA表達量。6、檢測血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)、TGR5過表達病毒對CFs增殖的影響:(1)Ang Ⅱ實驗分組設置為空白對照組:CFs+Ang II(0mol/L)組,Ang II干預組:CFs+Ang Ⅱ(10-5mol/L)組、CFs+Ang II(10-6mol/L)組、CFs+Ang Ⅱ(10-7mol/L)組;(2)TGR5實驗組設置為對照組:Ang Ⅱ+CFs組,病毒干預組:Ang Ⅱ+CFs-v(+)組、Ang Ⅱ+CFs-v(-)組,使用MTT法檢測各組經不同實驗條件干預后在不同時間點的OD值,計算細胞相對增殖或抑制率。7、檢測過表達TGR5及激動TGR5后對CFs增殖的影響:實驗分組為(1)CFs組;(2)CFs-v(+)組;(3)Ang Ⅱ+CFs-v(+)組;(4)Ang Ⅱ+CFs-v(-)組;(5)Ang Ⅱ+CFs-v(+)+諾米林(TGR5激動劑)組;(6)Ang Ⅱ+CFs-v(-)+諾米林組,使用MTT法檢測各實驗組干預不同時間后的增殖情況,使用Western Blot技術檢測各實驗組TGR5、P65蛋白的相對表達量,使用ELISA技術檢測各實驗組的c AMP、膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ含量。結果:1、CFs培養(yǎng)成功,熒光免疫法檢測CFs純度大于90%。2、RT-PCR結果:正常情況下TGR5 mRNA在乳小鼠CFs上的表達量極少,CFs組TGR5 mRNA表達量明顯少于心臟組、肝臟組、脾臟組,顯著差異(P0.05);CFs-v(+)組TGR5 mRNA表達量較CFs組明顯升高,P0.05。3、MTT結果:不同濃度的Ang Ⅱ對CFs均具有促增殖作用,Ang Ⅱ+CFs組的促增殖作用明顯強于CFs組(P0.05),而10-7mol/L Ang Ⅱ誘導24小時的促進增殖作用最強。感染TGR5過表達病毒后,與CFs組抑制細胞增殖作用比較,CFs-(+)組抑制細胞增殖作用明顯增強,P0.05。激動TGR5后,與Ang II+CFs-v(+)組抑制細胞增殖作用比較,Ang Ⅱ+CFs-v(+)+諾米林組的抑制細胞增殖作用明顯增強,P0.05;4、Western Blot結果:(1)感染TGR5后,與CFs組比較,CFs-v(+)組、Ang Ⅱ+CFs-v(+)組、Ang Ⅱ+CFs-v(+)+諾米林組上的TGR5蛋白表達量均明顯增高,P0.05;(2)感染TGR5病毒后,與CFs組比較,CFs-v(+)組上的P65蛋白表達量明顯減少,P0.05;激動TGR5后,與Ang Ⅱ+CFs-v(+)組比較,Ang Ⅱ+CFs-v(+)+諾米林組的P65蛋白表達量明顯減少,P0.05。5、ELISA結果:(1)感染TGR5病毒后,與CFs-v組比較,CFs-v(+)組胞漿中c AMP濃度明顯升高,P0.05;激動TGR5后,與Ang Ⅱ+CFs-v(+)組比較,Ang Ⅱ+CFs-v(+)+諾米林組胞漿中c AMP濃度較高,P0.05。(2)Ang Ⅱ誘導后,與CFs-v(+)組比較,Ang Ⅱ+CFs-v(+)組細胞合成分泌的膠原蛋白I/III量增多,P0.05;感染TGR5病毒后,與CFs組比較,CFs-v(+)組細胞合成分泌的膠原蛋白I/III量減少;激動TGR5后,與Ang Ⅱ+CFs-v(+)組比較,Ang II+CFs-v(+)+諾米林組細胞合成分泌的膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ量明顯減少,P0.05。結論:1、TGR5 mRNA在小鼠CFs上的表達量極少。2、激動TGR5,可通過增加胞漿中c AMP,減少P65核轉位。3、激動TGR5能抑制Ang Ⅱ誘導的CFs增殖及膠原蛋白分泌,其可能機制是通過NF-κB信號通路抑制Ang Ⅱ誘導的CFs增殖及膠原蛋白分泌。
【學位授予單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前6條

1 Jia Lei;Yang Yumin;Zhu Deli;Gao Xiaohui;Wang Xiaoling;Xing Huihui;Bao Junping;Shu Liang;;Anti-proliferative effect of the extract of Guangzao (Fructus Choerospondiatis) on cultured rat cardiac fibroblasts[J];Journal of Traditional Chinese Medicine;2015年06期

2 陳偉偉;高潤霖;劉力生;朱曼璐;王文;王擁軍;吳兆蘇;李惠君;鄭哲;蔣立新;胡盛壽;;《中國心血管病報告2014》概要[J];中國循環(huán)雜志;2015年07期

3 林快樂;蔡正艷;周偉澄;;膽汁酸受體TGR5激動劑研究進展[J];國際藥學研究雜志;2012年04期

4 辛毅;許秀芳;黃益民;張穎;李溫斌;;乳小鼠心肌成纖維細胞和心肌細胞的分離培養(yǎng)及熒光鑒定[J];新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報;2011年05期

5 劉玉梅;王保和;;心室重構時心肌膠原纖維的變化及基質金屬蛋白酶對其的影響[J];中國康復;2007年03期

6 陳勇兵,陳如坤,陳力,吳明,施立,楊文濤,錢永躍;乳鼠心肌成纖維細胞培養(yǎng)方法的改進[J];江蘇醫(yī)藥;2005年03期

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本文編號：1300117