發(fā)布時間：2017-10-28 04:29

  本文關(guān)鍵詞：多巴胺導(dǎo)電水凝膠心肌補(bǔ)片的制備及其對大鼠心肌梗死的修復(fù)作用

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【摘要】：研究背景隨著中國進(jìn)入老年化社會,一些老年疾病發(fā)生率也隨之上升。我國心肌梗死患者數(shù)量呈現(xiàn)逐年上升趨勢。根據(jù)WHO統(tǒng)計心血管事件是全球的頭號死亡原因。急性心肌梗死占各類心血管事件的40%以上,雖然臨床上有溶栓藥物、介入治療及冠狀動脈搭橋術(shù)的應(yīng)用及使心肌梗死范圍減小,最大限度的保護(hù)受損心肌細(xì)胞,但是心肌梗死后心肌細(xì)胞修復(fù)非常緩慢,使得已經(jīng)損失的心肌很難恢復(fù)。在過去30年中,心肌梗死發(fā)生后直接的死亡率(發(fā)生后30日內(nèi))降低到了10%,但一年內(nèi)的死亡率依然約為50%不變。血流再灌注引起的炎癥細(xì)胞浸潤,自由基的產(chǎn)生及心肌的異常性重構(gòu),使心肌梗死后心臟出現(xiàn)一系列繼發(fā)性病理性改變?nèi)纾簤乃佬谋谙蛲馀虺�、心臟破裂、心率失常、瘢痕愈合、心力衰竭等,影響心梗后患者的生活質(zhì)量。由于成人的心肌細(xì)胞的再生能力差,心肌梗死使受損的心臟組織失去心肌細(xì)胞和形成纖維疤痕組織會妨礙心肌的正常同步收縮,加重心臟健康部位的負(fù)荷,造成更多的心肌細(xì)胞死亡和心壁變形,將會嚴(yán)重影響心臟的功能。心肌梗死的高發(fā)病率,高死亡率和高復(fù)發(fā)仍然困擾著我們。為了解決這些問題,有人提出了在心臟組織內(nèi)注射新生的心肌細(xì)胞或者干細(xì)胞以替換和修復(fù)受損的心臟組織。其主要方法是在心肌壞死部位直接用注射器注射細(xì)胞以達(dá)到修復(fù)的效果,但是用此類方法會使注入的細(xì)胞不能固定于受損部位,容易滲入血流或者心室腔內(nèi)隨血流分布于身體其他部位,并且心肌梗死后造成的局部缺血并不利于通過注射移植的細(xì)胞生存,這將嚴(yán)重影響此類治療方式的治療效果。組織工程心肌補(bǔ)片(ECP)應(yīng)用于心肌梗死后的細(xì)胞修復(fù)是一種很有前景的治療方式,心肌補(bǔ)片主要是將細(xì)胞結(jié)合于組織工程支架上以促進(jìn)利用細(xì)胞治療心肌梗死的效率。組織工程支架能夠模仿天然心肌的結(jié)構(gòu)并具有心功能,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞附著和生長,促進(jìn)在體外的心肌功能化,并且可以修復(fù)體內(nèi)梗死部位的心肌恢復(fù)心功能,理想的心肌補(bǔ)片應(yīng)該具有如下這些特性：1、支架材料具有良好的彈性、可延展性、穩(wěn)定性、可塑性和有一定的機(jī)械強(qiáng)度,不會因心肌細(xì)胞的跳動損壞支架。2、具有良好的生物相容性,在體內(nèi)不引起炎癥反應(yīng)、毒性反應(yīng)和免疫排斥反應(yīng),當(dāng)心肌補(bǔ)片移植到動物模型體內(nèi),不會因心臟高速和高強(qiáng)度的跳動而脫離心肌梗死部位。3、心肌補(bǔ)片具有同步收縮的能力和良好的導(dǎo)電性能進(jìn)行生物電傳導(dǎo)并避免移植體內(nèi)后發(fā)生嚴(yán)重的心律失常。目前火多數(shù)心肌補(bǔ)片僅能解決上面提到的一到兩個特性。天然聚合物(明膠,海藻酸鈉,I型膠原和纖維蛋白)作為心臟修補(bǔ)具有良好的生物相容性,但是其彈性較弱,壓縮后不易回復(fù)原有形狀。大孔殼聚糖-明膠冷凍凝膠具有良好的彈性特性,但其導(dǎo)電性能微弱。為了解決細(xì)胞能夠緊密黏附于支架材料上且在心肌細(xì)胞劇烈跳動的情況下心肌細(xì)胞能夠帶動組織工程支架材料的運(yùn)動。我們模仿貽貝利用貽貝足蛋白緊密黏附于礁石上使貽貝不易被海浪吹走設(shè)計了仿貽貝導(dǎo)電冷凍水凝膠。研究表明將貽貝足蛋白破壞后能在其中找到左旋多巴,貽貝正是利用氧化的多巴和末氧化的多巴交聯(lián),形成高分子網(wǎng)狀聚合物黏附于礁石上。目前利用貽貝足蛋開發(fā)的生物粘合劑具有廣闊的前景,不僅用作手術(shù)縫合中的醫(yī)用膠粘劑,并且貽貝足蛋白還具有促進(jìn)細(xì)胞貼壁和增殖的功能利于傷口愈合及恢復(fù)。與其他醫(yī)學(xué)修復(fù)材料和藥物相比,貽貝足蛋白由于來源于生物與其特殊的分子結(jié)構(gòu),具有很好的生物相容性和可降解性,是一類極具優(yōu)勢和潛力的生物粘合劑。我們利用貽貝足蛋白提取的多巴胺以亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)作為交聯(lián)劑結(jié)合到帶有雙鍵的明膠上,制成帶有多巴胺的納米纖維,將極大的促進(jìn)細(xì)胞黏附。冷凍水凝膠是在零度一下的溫度合成的,其中反應(yīng)主要在液態(tài)／半冰凍階段經(jīng)過聚合反應(yīng)形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò),在低溫環(huán)境下水由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)形成冰晶。這些冰晶在解凍后能使水凝膠產(chǎn)牛相瓦鏈接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。過去也有其他方法用于制作大孔水凝膠如氣體發(fā)泡,纖維粘接,微滴乳狀液的形成,相分離,冷凍干燥,和致孔劑浸出。冷凍水凝膠的特點(diǎn)是其具有高度互聯(lián)的大孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠增強(qiáng)水凝膠的機(jī)械性能。我們利用明膠作為支架合成的冷凍水凝膠,但單純的明膠合成的冷凍水凝膠在壓力下容易破碎且彈性較小,并不能滿足作為心肌補(bǔ)片的條件。我們在其中加入明膠-甲基丙烯酸酯和聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEGDA),其經(jīng)常被用來提高水凝膠的機(jī)械性能。聚吡咯(PPY)是一種常見的導(dǎo)電材料,是一種黑色,無毒的高分子聚合物在空氣中穩(wěn)定性好。常用于組織工程心肌材料中其電導(dǎo)率可達(dá)102-103S/cm。在冷凍水凝膠內(nèi)加入分散的聚吡咯納米顆粒與合成的多巴胺納米纖維,在低溫下冷凍成膠合成具有良好的彈性與機(jī)械性能及優(yōu)良的導(dǎo)電性,使心肌細(xì)胞在支架材料上能夠帶動支架同步收縮,能夠滿足作為心肌補(bǔ)片的條件。目的：1.構(gòu)建符合心肌補(bǔ)片的組織工程支架材料并移植心肌細(xì)胞使其功能化,對體外構(gòu)建的心肌補(bǔ)片進(jìn)行形貌的表征與生物形容性等性質(zhì)進(jìn)行研究；2.體外構(gòu)建的組織工程心肌補(bǔ)片進(jìn)行心肌梗死SD大鼠體內(nèi)驗證;方法：1.心肌補(bǔ)片組織工程支架材料的合成與表征。分別合成多巴胺交聯(lián)劑(DOPA-MBA)、帶有雙鍵的明膠(MA-G)、帶雙鍵明膠的聚吡咯(MA-G-ppy)預(yù)聚物。將預(yù)聚物按照不同的組合分別合成基于多巴胺的導(dǎo)電冷凍水凝膠(DOPA-based MA-G/PEGDA/Ppy cryogel).不含多巴胺的導(dǎo)電冷凍水凝膠(MA-G/PEGDA/Ppy cryogel)、基丁多巴胺的彳不導(dǎo)電冷凍水凝膠(DOPA-based MA-G/PEGDA cryogel)不含有多巴胺的不導(dǎo)電冷凍水凝膠(MA-G/PEGDA cryogel).利用核磁共振氫譜檢測帶有雙鍵的明膠內(nèi)雙鍵比例,多功能數(shù)字式四探針測試儀測量樣品的導(dǎo)電率,英斯特朗萬能試驗機(jī)檢測冷凍凝膠的機(jī)械性能。2. 體外構(gòu)建的心肌補(bǔ)片進(jìn)行形貌的表征與生物形容性的檢測。購入1-3日齡SD大鼠乳鼠,收集足量心肌細(xì)胞與心肌成纖維細(xì)胞分別接種于不同冷凍凝膠上。利用活／死細(xì)胞染色法與CCK-8檢測不同冷凍水凝膠上培養(yǎng)相應(yīng)時間細(xì)胞的細(xì)胞活力。用掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)觀察接種有心肌細(xì)胞的冷凍水凝膠的超微結(jié)構(gòu)。體外免疫熒光與Western blot檢測心肌細(xì)胞間隙連接蛋白43(CX-43)與儀輔肌動蛋白(a-actinin)在DOPA-based MA-G/PEGDA/Ppy冷凍水凝膠與DOPA-based MA-G/PEGDA冷凍水凝膠支架材料上的表達(dá)。3.體外構(gòu)建的組織工程心肌補(bǔ)片進(jìn)行心肌梗死SD大鼠體內(nèi)驗證。雄性SD大鼠(250±20克)結(jié)扎左前降支使SD大鼠永久性心肌梗死。形成心肌梗死后14天,存活的大鼠接受超聲心動圖檢查。選擇FS30%的SD大鼠進(jìn)行實驗,隨機(jī)分為心肌梗死組和心肌梗死+心肌補(bǔ)片組。超聲心動圖檢測在舒張期和收縮期左心事內(nèi)部尺寸(分別為LVIDD和LVIDs),短軸縮短率(FS)和射血分?jǐn)?shù)(EF)。將不同實驗組SD大鼠處死后收集心臟并切片用馬森三色染色測量左心室梗死區(qū)域與未梗死區(qū)域面積的百分比,免疫熒光進(jìn)行a-actinin蛋白檢測并追蹤C(jī)M-Dil染色的心肌細(xì)胞。4.統(tǒng)計學(xué)分析以上實驗均設(shè)有陰性對照實驗,每次實驗至少重復(fù)3次。統(tǒng)計分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件完成,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)來表示。組間比較采用單囚素方差分析(One-way ANOVA),方差齊性的組間比較采用Tukey法,方差不齊的組問比較采用Dunnett's T3法,p0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果：1.支架材料的表征。為了計算明膠的雙鍵的百分比,我們使用吡咯作為標(biāo)準(zhǔn),因為吡咯核磁共振氫譜峰不與明膠的峰值重疊。根據(jù)吡咯的峰和雙鍵的峰的面積比,約40%的游離氨基是由MA攜帶在明膠上的。不同冷凍凝膠的機(jī)械性能是南應(yīng)力-應(yīng)變曲線和楊氏模量進(jìn)行檢測。帶有多巴胺的導(dǎo)電冷凍水凝膠能200-500千帕的壓力。其能夠在壓縮后立即回復(fù)原來的形狀。我們的結(jié)果顯示聚吡咯町以提高生物材料的機(jī)械強(qiáng)度。此外,我們的結(jié)果也證明了多巴胺交聯(lián)劑能夠調(diào)節(jié)冷凍水凝膠的剛度。聚吡咯和多巴胺在生物材料彈性和仿生楊氏模量上具有協(xié)同作用。掃描電鏡結(jié)果顯示,所有組的冷凍水凝膠均具有均勻的多孔結(jié)構(gòu)。所有組的孔徑均勻,分布良好。冷凍水凝膠的孔徑大小與他們的剛度一致。最小孔徑的冷凍水凝膠具有最高的楊氏模量。聚吡咯納米顆粒均勻分布帶有多巴胺的導(dǎo)電冷凍水凝膠表面。多巴-MBA作為交聯(lián)劑能夠?qū)⒕圻量┘{米顆粒固定在支架材料表面。2.帶有多巴胺的導(dǎo)電冷凍水凝膠具有良好的心肌細(xì)胞黏附,伸展和細(xì)胞活力。不同組冷凍水凝膠上接種的心肌細(xì)胞在培養(yǎng)6小時和24小時后用活死檢測試劑盒檢測細(xì)胞在冷凍水凝膠上的存活情況,含有多巴胺的冷凍水凝膠在心肌細(xì)胞培養(yǎng)6小時后,心肌細(xì)胞已在水凝膠上伸展,而不含有多巴胺的冷凍水凝膠上的細(xì)胞仍然呈現(xiàn)為圓形未伸展?fàn)顟B(tài)。培養(yǎng)24小時后心肌細(xì)胞已開始在含有多巴胺的冷凍水凝膠上增殖,數(shù)量明顯增多。利用CCK8試劑盒檢測在水凝膠上培養(yǎng)3天,7天,14天,28天的心肌細(xì)胞活力,顯示了心肌細(xì)胞活力在帶有多巴胺的冷凍水凝膠組細(xì)胞活力隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加細(xì)胞活力不斷增大,能夠維持較高的細(xì)胞活力直到28天,而不帶有多巴胺的冷凍水凝膠其細(xì)胞活力總是呈現(xiàn)在比較低的水平,在細(xì)胞培養(yǎng)14天后絀胞活力開始下降,并在28天后凝膠上的細(xì)胞數(shù)量已大大減少。3. DOPA-based MA-G/PEGDA/Ppy冷凍水凝膠體外實驗表明其能使心肌細(xì)胞功能化。在體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞于DOPA-based MA-G/PEGDA/Ppy冷凍水凝膠上,心肌細(xì)胞實現(xiàn)同步收縮,且?guī)又Ъ懿牧弦黄鹛鴦�。通過免疫熒光與western blot發(fā)現(xiàn)CX43與a-actinin的表達(dá)均是在DOPA-based MA-G/PEGDA/Ppy冷凍水凝膠上培養(yǎng)的心肌細(xì)胞表達(dá)比DOPA/MA-G/PEGDA冷凍水凝膠多。將體外培養(yǎng)于冷凍水凝膠上的心肌細(xì)胞通過掃描電鏡與透射電鏡觀察培養(yǎng)8天的心肌細(xì)胞,可見在DOPA-based MA-G/PEGDA/Ppy冷凍水凝膠上培養(yǎng)的心肌細(xì)胞表面黏附著一些細(xì)小顆粒,而DOPA/MA-G/PEGDA冷凍水凝膠上培養(yǎng)的心肌未見這些細(xì)小顆粒,我們猜測可能是Ppy黏附于心肌細(xì)胞表面,在支架材料上的心肌細(xì)胞膜表面有許多黑色的Ppy納米顆粒,心肌細(xì)胞內(nèi)部存在肌節(jié)。4.移植心肌補(bǔ)片于心肌梗死的SD大鼠能促進(jìn)大鼠左心室功能的恢復(fù)。移植心肌補(bǔ)片至心肌梗死大鼠左心室在超聲心動圖上顯示,其FS、EF相對未移植心肌補(bǔ)片的心肌梗死大鼠均有較大提高。將移植心肌補(bǔ)片的心肌梗死大鼠與未移植心肌補(bǔ)片的大鼠心臟切片進(jìn)行馬森三色染色,其中移植有心肌補(bǔ)片的大鼠其心梗范圍縮小,心肌細(xì)胞移植進(jìn)入心肌梗死部位對瘢痕組織進(jìn)行修復(fù)。同樣的將切片進(jìn)行免疫熒光染色,可見在大鼠瘢痕組織內(nèi)出現(xiàn)大量的心肌細(xì)胞,其在心肌補(bǔ)片上存在大量與支架材料結(jié)合的心肌細(xì)胞,而未移植心肌補(bǔ)片的大鼠其瘢痕組織內(nèi)未見心肌細(xì)胞且心壁顯得更加菲溥。結(jié)論：在本研究中,以多巴胺-MBA作為交聯(lián)劑成功制備帶有多巴胺的導(dǎo)電冷凍水凝膠。這種導(dǎo)電生物材料具有超彈性和良好的導(dǎo)電性。此外,該導(dǎo)電冷凍水凝膠與心肌細(xì)胞具有較強(qiáng)的親和性和提高心肌細(xì)胞的功能化。兇此,貽貝啟發(fā)導(dǎo)電冷凍水凝膠加載心肌細(xì)胞心肌補(bǔ)片植入到心肌梗死SD大鼠梗死部位,它顯示供體細(xì)胞能夠保留在心肌補(bǔ)片支架上并且遷移到心肌梗死的疤痕部位,梗死區(qū)域有新的心肌形成并提高心功能。因此,含有多巴胺的導(dǎo)電冷凍水凝膠是一類具有前景的心臟支架。
【關(guān)鍵詞】：貽貝啟發(fā)多的巴胺交聯(lián)劑 超彈性冷凍水凝膠 導(dǎo)電水凝膠 組織工程心肌補(bǔ)片 心肌梗死
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R542.22
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-22
• 第一章 組織工程心肌補(bǔ)片體外構(gòu)建及表征22-44
• 引言22-24
• 1. 實驗設(shè)備與材料24-28
• 2. 實驗方法和步驟28-32
• 3. 實驗結(jié)果與討論32-42
• 4. 結(jié)論42-44
• 第二章 組織工程心肌補(bǔ)片的體外驗證44-55
• 引言44-45
• 1. 實驗材料與設(shè)備45-47
• 2. 實驗方法與步驟47-49
• 3 實驗結(jié)果與討論49-53
• 4. 結(jié)論53-55
• 參考文獻(xiàn)55-62
• 全文小結(jié)62-63
• 中英文對照縮略詞表63-64
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果64-66
• 致謝66-69

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10 洪仕君;甲基苯丙胺依賴鼠相關(guān)腦區(qū)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體、D1和D2受體、五羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)及依賴機(jī)制研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2009年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳玉冰;基于表面等離子體共振的多巴胺反應(yīng)體系研究[D];西南交通大學(xué);2015年

2 仲曉燕;基于聚多巴胺納米顆粒的腫瘤放化療協(xié)同治療研究[D];蘇州大學(xué);2016年

3 鄭述祥;仿生粘附納米TiO_2合成及其固載脂肪酶界面特性研究[D];安徽工程大學(xué);2016年

4 趙超;金屬有機(jī)骨架化合物MIL-88(Fe)在多巴胺檢測中的應(yīng)用研究[D];西南大學(xué);2016年

5 劉書君;聚多巴胺基納米復(fù)合材料的制備及其在催化領(lǐng)域的應(yīng)用[D];鄭州大學(xué);2016年

6 王佩蘭;基于聚多巴胺的表面增強(qiáng)拉曼基底的制備及應(yīng)用[D];上海師范大學(xué);2016年

7 李衛(wèi);仿生多巴胺在光催化和光引發(fā)聚合中的應(yīng)用研究[D];石河子大學(xué);2016年

8 華文熙;多巴胺導(dǎo)電水凝膠心肌補(bǔ)片的制備及其對大鼠心肌梗死的修復(fù)作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

9 李琳;多巴胺經(jīng)D2類受體抑制脂多糖誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

10 張世思;腦內(nèi)多巴胺活動水平對大鼠新穎尋求行為的影響[D];西南大學(xué);2014年

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本文編號：1106695