本文關(guān)鍵詞：凝血酶切割骨橋蛋白在肝纖維化中的作用研究

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【摘要】：研究背景和目的肝臟纖維化是由于包括膠原蛋白在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)蛋白的過度積累所導(dǎo)致的。肝臟纖維化可以發(fā)生在大部分的慢性肝臟疾病。目前,纖維化被認(rèn)為是機(jī)體的一種應(yīng)答反應(yīng),是機(jī)體對(duì)慢性肝臟疾病導(dǎo)致的肝臟反復(fù)損傷的一個(gè)損傷-修復(fù)反應(yīng),同時(shí)伴隨修復(fù)和再生的過程。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)的活化被作為ECM沉積的中心事件。在細(xì)胞因子刺激之后,靜止的HSCs增殖并轉(zhuǎn)分化為具有促炎和促纖維化功能的纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞。而且,活化的HSCs能夠分泌一系列的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,對(duì)于維持HSCs的活化狀態(tài)是有利的。在這些細(xì)胞因子中,TGF-β是肝臟中最有效的致纖維化的細(xì)胞因子,它可以刺激ECM蛋白的合成。目前大量研究證實(shí)HSCs的活化和增值大多是TGFβ依賴途徑的。全長(zhǎng)OPN (full length OPN, OPN-FL)是一種可溶性的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,也是一種磷酸化糖蛋白。OPN蛋白包含一個(gè)經(jīng)典的與細(xì)胞表面受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域--精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸結(jié)構(gòu)域(arginine-glycine-aspartic acid, RGD),這個(gè)結(jié)構(gòu)域能夠被細(xì)胞表面的整合素受體αvβ3,αvβ5,α4β1, and α8β1識(shí)別。這些識(shí)別RGD的整合素可表達(dá)于多種細(xì)胞表面,包括成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞。OPN-FL在RGD結(jié)構(gòu)域外臨近的氨基酸序列能夠被凝血酶識(shí)別并切割。OPN-FL被凝血酶切割之后稱為凝血酶切割的OPN (Thrombin-cleaved OPN, Thr-OPN),暴露出了一個(gè)新的整合素受體結(jié)合的位點(diǎn)--SVVYGLR序列(在小鼠中為SLAYGLR),這個(gè)位點(diǎn)可以被整合素α4β1和α9β1識(shí)別。肝臟纖維化可以發(fā)生在大部分類型的慢性肝臟疾病中,包括慢性乙型病毒(hepatitis B virus, HBV)感染,慢性丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH).酒精性肝臟疾病(alcoholic liver disease, ALD)和原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC).近來的報(bào)道指出血漿OPN-FL在肝纖維化患者中升高,其升高的水平可以用于預(yù)測(cè)肝硬化的進(jìn)展,并且OPN-FL能夠誘導(dǎo)HSCs的活化。在動(dòng)物模型中OPN的缺乏可以保護(hù)小鼠抵抗肝臟纖維化進(jìn)展�？傊�,OPN參與了大部分類型慢性肝臟疾病中肝纖維化的過程。但是由于OPN可以以多種形式存在于細(xì)胞內(nèi)外, 并且能夠與一系列整合素受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用,具體是哪一種形式的OPN在肝纖維化中發(fā)揮作用,以及通過哪個(gè)受體發(fā)揮作用是不清楚的。這些都是亟待解決的。Thr-OPN暴露一個(gè)新的整合素結(jié)合位點(diǎn)--SVVYGLR(小鼠中為SLAYGLR)序列,能夠促進(jìn)了表達(dá)整合素α4和α9的細(xì)胞的粘附。近來的研究表明,Thr-OPN參與了酒精誘導(dǎo)小鼠酒精相關(guān)性肝病模型和ConA誘導(dǎo)的小鼠肝炎模型中肝炎的發(fā)病機(jī)制。另外,也有研究指出Thr-OPN在心肌纖維化模型中促進(jìn)了III型膠原蛋白的合成。然而,關(guān)于Thr-OPN在人類疾病中的作用研究很少,關(guān)于Thr-OPN在肝硬化中的功能亦知之甚少。因此,本文擬研究Thr-OPN在肝纖維化患者中的表達(dá)情況以及是否明顯參與了肝硬化的進(jìn)展。第一部分：Thr-OPN在肝纖維化患者中的表達(dá)及其對(duì)HSCs的活化和功能影響目的：明確Thr-OPN在肝纖維化患者中的表達(dá)情況,探索Thr-OPN對(duì)HSCs的活化和功能影響。方法：1)通過收集健康人,慢乙肝患者以及慢乙肝相關(guān)肝纖維化患者樣本,通過ELISA方法檢測(cè)其主要Thr-OPN、OPN-FL和TGF-β在肝纖維化患者中的表達(dá)情況。并分別分析Thr-OPN. OPN-FL和血漿中肝纖維化非侵入性指標(biāo)(透明質(zhì)酸,III型前膠原和IV膠原)以及TGF-β之間的相關(guān)性2)利用肝星狀細(xì)胞株LX2細(xì)胞,并通過western blot, PCR, ELISA, MTS和微流控系統(tǒng)等方法研究Thr-OPN對(duì)HSCs的活化、增殖、遷移和膠原合成功能影響。結(jié)果：1)肝硬化患者血漿Thr-OPN水平明顯高于慢乙肝和健康志愿者。2)肝硬化患者Thr-OPN的表達(dá)與血漿中肝纖維化非侵入性指標(biāo)透明質(zhì)酸,III型前膠原和IV膠原的水平均呈明顯正相關(guān),也與TGF-p水平呈明顯的正相關(guān)。3) Thr-OPN能夠活化HSCs,并促進(jìn)其自身分泌TGF-p,有利于HSCs活化狀態(tài)的維持,同時(shí)能夠增強(qiáng)HSCs膠原生成能力,以及細(xì)胞的增殖和遷移能力。和OPN-FL相比,Thr-OPN具有更強(qiáng)的促進(jìn)HSCs活化、膠原生成、增殖和遷移的能力。第二部分：建立CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化進(jìn)展模型,證實(shí)Thr-OPN參與肝纖維化的進(jìn)展目的：采用CCl4誘導(dǎo)肝纖維化進(jìn)展模型,研究Thr-OPN在小鼠肝纖維化模型的表達(dá)以及與纖維化發(fā)展之間的關(guān)系,證實(shí)Thr-OPN影響肝纖維化的進(jìn)展。方法：1)建立CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化進(jìn)展模型,首先通過Masson三色染色評(píng)估了肝纖維化程度；并通過ELISA方法檢測(cè)肝臟組織中Thr-OPN和OPN-FL的表達(dá)；肝纖維化進(jìn)展模型中肝組織HSCs的活化以及膠原合成的相關(guān)指標(biāo)通過western blot, PCR,和免疫組化檢測(cè)2)通過western blot, PCR,免疫組化,免疫熒光等方法檢測(cè)肝纖維化患者和小鼠的肝臟組織中整合素受體α4和a9的表達(dá)情況。并利用肝星狀細(xì)胞株LX2細(xì)胞,檢測(cè)Thr-OPN刺激后肝星狀細(xì)胞中整合素受體α4和α9的表達(dá)情況。結(jié)果：1)在小鼠肝纖維化進(jìn)展中,Thr-OPN表達(dá)水平持續(xù)增高。2)在小鼠肝纖維化進(jìn)展中,Thr-OPN的表達(dá)與肝臟纖維化程度以及肝臟中HSCs活化和膠原蛋白形成密切相關(guān)。3)肝硬化患者肝臟組織中Thr-OPN的整合素受體α4和α9的高表達(dá),在小鼠肝纖維化進(jìn)展模型中隨著纖維化程度的加重,肝組織中Thr-OPN的整合素受體α4和α9的表達(dá)逐漸增加,體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Thr-OPN活化HSCs后同時(shí)能夠誘導(dǎo)HSCs高表達(dá)其自身受體整合素α4和α9。第三部分：利用OPN基因敲除小鼠及Thr-OPN有效肽段,證實(shí)Thr-OPN影響肝纖維化的進(jìn)展目的：通過OPN基因敲除小鼠誘導(dǎo)肝纖維化模型并給予Thr-OPN切割后暴露的有效肽段,證實(shí)Thr-OPN影響肝纖維化的進(jìn)展方法：體內(nèi)凝血酶原的普遍存在,使體內(nèi)特異性缺失Thr-OPN的狀態(tài)不能夠?qū)崿F(xiàn)。因此為了研究Thr-OPN在纖維化中的作用,我們應(yīng)用OPN基因敲除小鼠,完全去除各種形式的OPN的功能,然后給予小鼠OPN-FL在凝血酶切割后暴露的有效肽段(M5 peptide),通過Masson三色染色等方法檢測(cè)CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型的纖維化程度。結(jié)果：1)在小鼠肝纖維化中,OPN缺乏能夠減輕肝纖維化程度2)凝血酶切割OPN后暴露的有效肽段(M5 peptide)能夠加重OPN基因敲除小鼠肝纖維化。結(jié)論：與肝炎患者和健康志愿者相比,Thr-OPN在肝硬化患者中表達(dá)明顯增高,并且Thr-OPN水平與促肝纖維化因子TGF-β水平呈明顯正相關(guān)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Thr-OPN的表達(dá)與肝臟纖維化程度以及肝臟中HSCs活化和膠原蛋白形成緊密相關(guān)。并且其整合素受體α4和α9的肝纖維化進(jìn)展中高表達(dá)。與OPN-FL相比,Thr-OPN能夠有效活化HSCs,促進(jìn)其增殖,遷移以及膠原合成的功能,并促進(jìn)HSCs高水平表達(dá)Thr-OPN整合素受體α4和α9。因此我們推測(cè)Thr-OPN通過整合素受體α4和α9參與肝纖維化進(jìn)展,并在促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。
【關(guān)鍵詞】：OPN Thr-OPN 肝纖維化 肝星狀細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 致謝6-7
• 中文摘要7-12
• Abstract12-17
• 縮略詞表17-20
• 序言20-24
• 第一部分：Thr-OPN在肝纖維化患者中的表達(dá)及其對(duì)HSCs的活化和功能影響24-58
• 1 引言24-26
• 2 研究對(duì)象,材料和方法26-45
• 2.1 研究對(duì)象26-27
• 2.2 材料和試劑27-33
• 2.3 方法33-45
• 3 結(jié)果45-56
• 3.1 肝硬化患者血漿Thr-OPN水平明顯高于慢乙肝患者和健康志愿者45-48
• 3.2 Thr-OPN的表達(dá)與血漿中肝纖維化非侵入指標(biāo)的水平呈明顯正相關(guān)48-50
• 3.3 血漿中Thr-OPN的表達(dá)與TGF-β水平呈明顯的正相關(guān)50-51
• 3.4 Thr-OPN對(duì)HSCs的活化、增殖、遷移以及產(chǎn)生膠原的能力的影響51-56
• 4 討論56-58
• 第二部分：建立CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型,證實(shí)Thr-OPN參與肝纖維化的進(jìn)展58-92
• 1 引言58-59
• 2 實(shí)驗(yàn)材料和方法59-77
• 2.1 動(dòng)物59
• 2.2 材料和試劑59-65
• 2.3 方法65-77
• 3 結(jié)果77-89
• 3.1 在小鼠肝纖維化進(jìn)展過程中,Thr-OPN表達(dá)水平持續(xù)增高77-81
• 3.2 Thr-OPN的表達(dá)與肝臟中HSCs活化和膠原蛋白形成緊密相關(guān)81-84
• 3.3 Thr-OPN活化HSCs后同時(shí)能夠誘導(dǎo)其自身受體整合素α4和α9高表達(dá)84-89
• 4 討論89-92
• 第三部分：利用OPN基因敲除小鼠及Thr-OPN有效肽段,證實(shí)Thr-OPN參與肝纖維化的進(jìn)展92-105
• 1 引言92-93
• 2 實(shí)驗(yàn)材料和方法93-100
• 2.1 動(dòng)物93-94
• 2.2 肽段制備94
• 2.3 材料和試劑94-97
• 2.4 方法97-100
• 3 結(jié)果100-103
• 3.1 OPN缺乏能夠減輕CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化100-101
• 3.2 凝血酶切割OPN后暴露的有效肽段(M5 peptide)能夠加重OPN基因敲除小鼠肝纖維化101-103
• 4 討論103-105
• 參考文獻(xiàn)105-113
• 綜述113-131
• 參考文獻(xiàn)120-131
• 作者簡(jiǎn)歷131-134

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