本文關鍵詞：ω-3多不飽和脂肪酸對梗阻性黃疸大鼠腸損傷干預作用及機制研究

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【摘要】：研究基礎梗阻性黃疸(obstructive jaundice,0J)是一種肝膽外科常見臨床病理綜合征,近年來,大量基礎研究發(fā)現0J導致的腸黏膜屏障功能損傷和肝網狀內皮細胞功能障礙,是細菌/內毒素移位的關鍵,也是0J病人多臟器功能障礙的重要誘發(fā)因素。0J時,構成腸道屏障功能的機械屏障、免疫屏障、生物屏障以及化學屏障等均受到不同程度損害,導致腸粘膜通透性增高,內毒素吸收入血增加；同時腸道內毒素的清除能力下降；加之腸道微生態(tài)動態(tài)平衡破壞,細菌移位也更易發(fā)生,最終發(fā)生腸源性內毒素血癥,繼而誘發(fā)全身多器官功能損害。目前針對0J機體全身多臟器功能損害始動因素的研究,主要著眼點集中在腸粘膜屏障功能障礙,以及細菌/內毒素經門脈系統(tǒng)移位并擴散至全身,形成內毒素血癥等情況的探討。近年研究證實,腸粘膜屏障功能受損,LPS等與腸上皮細胞直接接觸,可以激活腸上皮及腸道相關淋巴組織,導致腸源性細胞因子和其它炎癥介質的釋放,經淋巴途徑進入體循環(huán),造成機體損傷。檢索國內外相關資料,針對0J機體中關于非細菌性、腸源性組織損傷因子的闡述較少,特別是對腸源性物質移位至體循環(huán)的另一重要途徑“腸-淋巴途徑”,在0J機體中的變化及意義等方面的研究更為少見。高遷移率族蛋白1(HMGB1),近年作為一種重要的晚期炎癥介質得到深入研究。一方面其可由單核細胞、巨噬細胞等激活的免疫細胞、腸上皮細胞等多種有核細胞主動分泌；再者也可從壞死或損傷的細胞中被動釋放到細胞外或外周血循環(huán),這表明HMGB1既是炎癥的早期啟動者(部分壞死細胞被動釋放HMGB1),更是晚期炎癥的促進者(巨噬細胞等主動分泌HMGB1)。在HMGB1受體及信號轉導途徑中,除了晚期糖基化終末產物受體(RAGE)以外,Toll樣受體(TLRs)也是HMGB1的另一類重要家族受體,近來研究證實其作為TLR-2/4等重要的內源性配體,兩者相互結合后可進一步通過MyD88等多種通路激活核轉錄因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB),促進細胞因子和其他炎癥介質的表達,導致炎癥反應的發(fā)生。動物模型及部分臨床研究均表明,HMGB1在許多疾病如膿毒血癥、肺臟急性炎癥損傷、腸道、肝臟炎癥、關節(jié)炎、心血管疾病及許多自身性免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中都起到了重要作用。機體發(fā)生梗阻性黃疸時同樣伴有肝臟、肺臟及腎臟等全身多臟器功能損害,但目前在0J機體所致腸損傷中,HMGB1的表達變化研究極少。ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acids, ω-3 PUFA)作為一種重要的免疫腸內營養(yǎng)制劑,大量體內外研究[42-47]證實：ω-3 PUFA可通過抑制免疫細胞增殖及活化、減少促炎細胞因子的產生、抑制粘附分子表達、影響抗原提呈等多種途徑發(fā)揮免疫調節(jié)效應。動物實驗及臨床研究證實ω-3 PUFA在多種病理生理過程中均發(fā)揮積極作用；如上述,ω-3 PUFA是否也可調節(jié)0J機體中HMGB1的表達水平改變,通過TLR途徑調節(jié)機體炎癥反應仍是未知。這個問題值得我們進一步探討。為此,本課題首先建立0J動物模型,予以應用富含ω-3多不飽和脂肪酸的魚油干預,并行腹部胸導管置管引流淋巴液,通過對外周血液、淋巴液中細胞因子(TNF-α、IL-1β及IL-10)、 NO及HMGB1測定,明確ω-3 PUFA干預的影響；推測上述細胞因子或炎癥介質的可能來源。進一步對比分析腸粘膜組織中HMGB1與Toll樣受體-4(TLR4)及NF-κB蛋白表達變化,明確“腸—淋巴途徑”及HMGB1等在0J導致腸屏障功能損害中的作用,然后應用富含ω-3 PUFA處理,進一步探討ω-3多不飽和脂肪酸對0J機體保護作用的可能機制。第一部分：ω-3 PUFA干預梗阻性黃疸大鼠血液及淋巴液中細胞因子對比觀察目的：1.改良腹部胸導管置管過程,建立簡潔的淋巴管置管及淋巴液引流的方法。2.對比觀察血液及淋巴液中TNF-α、IL-1β、IL-10、NO及HMGB1含量變化,以及ω-3 PUFA干預后的影響。方法：SPF級雄性wistar大鼠72只,隨機分為：梗阻性黃疸(0J)組(n=24),梗阻性黃疸+ω-3 PUFA組(OJPUFA)組(n=24)及Sham組(n=24)。根據標本收集時間的不同,再次隨機分為d3、d7及d14三組。梗阻性黃疸模型通過膽總管雙重結扎法建立,僅OJPUFA組動物自術后第1天,給予ω-3PUFA按0.4g. kg-1.d-1劑量灌胃,其余組動物相應時間點等量生理鹽水灌胃作為對照。各組大鼠分別于術后第3、7、14天腹部胸導管置管收取淋巴液,以及下腔靜脈血液、回腸組織等標本,分別予以置-80℃冰箱或10%中性甲醛固定后保存。利用全自動生化分析儀檢測總膽紅素(TBIL)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)等生化指標。ELISA測定TNF-α、IL-1β、IL-10及HMGB1含量,硝酸還原酶(微板法)測定NO含量。采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以mean±SD表示,計量資料先進性正態(tài)性檢驗(Shapiro-Wilk),所有參數均符合正態(tài)分布。兩樣本均數的比較采用兩獨立樣本t檢驗；組間均數的比較應用單因素方差分析(one-way ANOVA),對于方差分析顯著,且滿足方差齊性要求的多重比較,應用LSD法(least significant difference,最小顯著差值法)檢驗；不滿足方差齊性要求的多重比較,應用Dunnett's T3法檢驗；統(tǒng)計圖用SigmaPlot 10.0繪制。按檢驗水準α=0.05,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果：1.通過充分游離腹主動脈間接顯露腹部胸導管,操作過程簡單,置管成功率高,收集淋巴液量相對較大,能滿足后續(xù)實驗要求。2.一般情況：本實驗所有動物均未發(fā)生術后切口感染或切口裂開等并發(fā)癥,實驗過程中OJl4d組死亡1只(腸梗阻),余無動物死亡。0J與OJPUFA組大鼠術后第1-3天,體重有下降趨勢,7天以后均恢復至術前體重,但任一相同時間點,較Sham組體重明顯減低；d14時間點時OJPUFA組大鼠體重高于0J組,且差異有顯著性(P=0.0000.05),但都顯著低于Sham組(P0.05)。3.肝臟功能指標變化：Sham組TBIL及DBIL水平在整個實驗過程中沒有明顯變化,0J組與OJPUFA組血清TBIL及DBIL水平自術后第3日起較Sham組明顯增高,但該兩組之間相比差異均無顯著性(P=0.786,0.790,0.8810.05),(P=0.855,0.324,0.5300.05)。Sham組ALT及AST水平在整個實驗過程中波動幅度較小。0J組與OJPUFA組中血清ALT及AST水平,自術后第3天起較Sham組明顯增高,但差異無顯著性,隨時間推移,此二者血清水平均成進行性升高趨勢,至術后14天,0J組ALT及AST均顯著高于OJPUFA組(P=0.014,0.0120.05)。4.血清及淋巴液中TNF-α的變化：假手術組大鼠血清及淋巴液中TNF-α水平隨時間延長,逐漸下降,至14d降至最低點。與Sham相反,0J組和OJPUFA組大鼠血清及淋巴液中TNF-α含量均在第7d時達到最高值,然后下降,但在相同的檢測時間,均顯著高于假手術組。OJPUFA組血清及淋巴液中TNF-α濃度均低于0J組水平,在d14時間點顯著低于0J組(P=0.0140.05)。Sham組大鼠血清及淋巴液中,TNF-α的含量相近,差異無顯著性(P0.05)。而在任一相同時間點,0J組和OJPUFA組大鼠淋巴液中TNF-α的濃度,均顯著高于相對應組別內血清含量水平(P0.05)。5.血清及淋巴液中IL-1β的變化：Sham組大鼠血清及淋巴液中IL-1 β水平在術后逐漸下降,至14d時水平最低。0J組和OJPUFA組大鼠血清及淋巴液均在d14時達到最高值,且在任一相同時間點,均顯著高于假手術組。在第14d時0J組IL-1β濃度絕對值水平顯著高于OJPUFA組(P=0.0200.05)。0J組與OJPUFA組淋巴液IL-1β含量變化與血清含量變化趨勢相似,在7d及14d兩個時間點,OJPUFA組內濃度均顯著低于0J組(P=0.019,0.0000.05)。Sham組大鼠血清及淋巴液中,IL-1β含量相似。在d 3、d7時間點,0J組和OJPUFA組大鼠淋巴液中IL-1β的濃度,均顯著高于血清內的含量(P0.05)。6.血清及淋巴液中IL-10的變化：0J組和OJPUFA組大鼠血清及淋巴液中IL-10含量均顯著高于假手術組,且均呈現進行性升高趨勢,以0J組升高更為顯著。在d14時間點,0J組血清IL-10水平顯著高于OJPUFA組(P=0.0160.05)。淋巴液中IL-10含量,在術后任一相同時間點0J與OJPUFA組無顯著性差異(P=0.657,0.708,0.2460.05)。在3d、7d時間點,血清IL-10的含量顯著高于淋巴液水平(P0.05)。在14d時間點,血清中工L-10的水平仍高于淋巴液含量,但差異無顯著性(P0.05)。7.血清及淋巴液中HMGB1的變化：Sham組大鼠血清及淋巴液中HMGB1水平逐漸降低。0J組和OJPUFA組大鼠血清及淋巴液中HMGB1含量均顯著高于假手術組。在d7及d14,OJPUFA組血清HMGB1水平顯著低于0J組(P=0.008,0.0020.05)。在d14時間點OJPUFA組大鼠淋巴液中HMGB1含量顯著低于0J組(P=0.0310.05)。Sham組內血清及淋巴液中HMGB1水平差異無顯著性。在d3及d7兩個時間點,0J組和OJPUFA組大鼠血清中HMGB1的水平高于淋巴液中的含量,但差異無顯著性(P0.05)。隨后,淋巴液中HMGB1的含量升高更為迅速,d14時間點,淋巴液中HMGB1的水平即顯著高于血清含量(P0.05)。8.血清及淋巴液中NO的變化：在任一時間點,0J組和OJPUFA組血清及淋巴液中NO水平均顯著高于Sham組。在d7、d14時間點,OJPUFA組血清NO水平顯著低于0J組(P=0.032,0.0210.05)。在d14時間點,0J組淋巴液中NO水平顯著高于OJPUFA組(P=0.0020.05)。相同時間點、相同組別,血清及淋巴液中NO含量對比分析提示,兩者之間無顯著性差異(P0.05)。研究結論：1.通過充分游離腹主動脈來間接顯露腹部胸導管,符合此二者之間的解剖關系,更有利于胸導管顯露,創(chuàng)傷減少,操作簡單,淋巴液引流量相對較大,可用于需要開腹手術的大鼠疾病模型中引流淋巴液的研究。2.ω-3多不飽和脂肪酸干預后,在一定程度上改善了大鼠體重及肝臟功能,但在膽道梗阻未解除的前提下,ω-3 PUFA干預對大鼠一般情況及肝臟功能的改善等方面作用是有限的。3.ω-3多不飽和脂肪酸干預,能減弱促炎因子HMGB1、TNF-α及IL-1β的釋放,避免IL-10水平過度升高,改善0J機體免疫紊亂狀態(tài),減弱機體大量分泌NO所介導的損害反應。4. TNF-α及IL-1β可能主要來源于0J機體腸道淋巴等組織的分泌；淋巴液中IL-10及NO可能不是0J機體的主要來源。而HMGBl在膽道梗阻后早期,淋巴液中的HMGBl可能不是機體的主要來源,但隨梗阻時間延長,腸道淋巴等組織的分泌增加更為顯著。第二部分：ω-3PUFA對梗阻性黃疸大鼠小腸損傷的影響及機制目的：觀察ω-3 PUFA對梗阻性黃疸大鼠回腸形態(tài)學及杯狀細胞數量變化的影響；以及HMGB1/TLR4信號轉到途徑在0J損害中的作用及可能機制。方法：本研究第一部分留取的回腸標本,應用于本實驗研究。HE及AB-PAS染色觀察腸粘膜形態(tài)學及杯狀細胞變化；免疫組織化學染色觀察HMGB1、TLR4及NF-Kbp65在腸粘膜表達變化；qRT-PCR及Western-blot檢測回腸組織HMGB1、 TLR4及NF-Kb p65 mRNA及蛋白表達變化。統(tǒng)計學方法同第一部分。結果：1.腸道組織病理學變化假手術組：腸絨毛結構清晰,無充血水腫,間質內無明顯炎性細胞浸澗,上皮細胞完整。0J組：自d3開始,粘膜絨毛水腫逐漸加重,間質可見充血,炎性細胞浸潤逐漸增多,絨毛之間的間隙逐漸增大,粘膜高度逐漸降低,腺窩深度變淺,開口逐漸增寬,絨毛長度與腺窩深度的比例逐漸降低,在d14時間點,絨毛顯著縮短,可見部分絨毛上皮細胞脫落缺失明顯,部分區(qū)域潰瘍形成。OJPUFA組,在d3、d7時間點,肉眼觀無明顯差別,至d14時間點可見絨毛粗短,但結構相對完整,絨毛脫落及潰瘍形成少見。對第14天,小腸絨毛高度、隱窩深度以及二者的比值進一步對比可見,假手術組絨毛高度顯著高于0J組及OJPUFA組,且以0J組降低更為顯著,與OJPUFA組相比(P=0.0000.05)；在隱窩深度方面的變化趨勢與絨毛高度變化趨勢相近；而對于絨毛高度/隱窩深度比值方面,假手術組顯著高于0J組及OJPUFA組(P0.05),差異有顯著性。盡管OJPUFA組高于0J組,但二者比較無顯著性差異(P=0.1070.05)。2. AB-PAS染色顯示回腸杯狀細胞吸光度值變化Sham組大鼠中,小腸杯狀細胞呈藍染,均勻分布于腸黏膜上皮內,細胞飽滿,在各時間點無明顯差異。而0J組和OJPUFA組大鼠,腸絨毛水腫顯著,在d3時間點杯狀細胞吸光度值稍高于假手術組,在d7、d14時間點杯狀細胞數量明顯減少,均顯著低于任一相同時間點假手術組含量,且0J組下降更為明顯,在d14時間點,顯著低于OJPUFA組水平(P=0.0350.05)。3.回腸組織中HMGB1, TLR4及NF-κb p65蛋白表達變化(免疫組織化學染色及Western-blot定量)3.1 HMGB1Sham組大鼠腸粘膜上皮細胞內僅見少許淡黃色顆粒,在任何時間點表達均不顯著。而0J和OJPUFA組在d3時間點就可見顯著黃染,染色陽性區(qū)域主要位于絨毛頂端,主要位于腸粘膜上皮細胞核內,胞漿內表達少,同時間質中的炎癥細胞也可見陽性表達。d7時間點,0J組整個絨毛上皮細胞的胞核及胞漿均可見明顯黃染,間質中的炎癥性細胞的表達量亦明顯增加；而OJPUFA組的陽性表達主要位于細胞核內,也呈現彌漫性表達增強。在d14時間點,在0J組中HMGB1表達也顯著增強,腸粘膜上皮細胞胞核、胞漿甚至胞外都可見明顯棕黃色乃至棕褐色顆粒沉著,間質中的炎癥細胞也呈現相同的染色結果。OJPUFA組也有相似變化趨勢,但染色程度明顯變淺。Western-blot檢測提示,Sham組大鼠HMGB1始終維持于較低水平,與0J組及OJPUFA組相比,顯著降低(P0.05),d3時間點開始,0J組和OJPUFA組大鼠小腸內HMGB1的含量均顯著高于假手術組,以0J組變化最為顯著,第14d時,0J組小腸內HMGB1水平即顯著高于OJPUFA組(P=0.0010.05)。3.2 TLR4Sham組大鼠腸粘膜上皮細胞膜表面未見明顯黃染。0J和OJPUFA組在d3時間點就可見少許黃染,位于絨毛頂端,在d7時間點,0J組腸上皮細胞膜表面可見明顯黃染,間質中的炎癥性細胞也可見少許陽性表達；在d14時間點,0J組腸絨毛頂端細胞膜顯著黃染,致部分上皮細胞膜清晰可見；而OJPUFA組陽性表達程度明顯弱于0J組。Western-blot顯示,Sham組大鼠TLR4始終維持于較低水平,與免疫組化染色結果一致。d3時間點開始,0J組和OJPUFA組大鼠小腸內TLR4的含量均顯著高于假手術組,且表達量逐漸增多,0J組變化最為顯著。在d14,0J組小腸內TLR4的水平即顯著高于OJPUFA組(P=0.0000.05)。3.3 NF-κb p65Sham組大鼠腸粘膜上皮細胞核內僅見少許淡黃色顆粒,0J組和OJPUFA組在d3、d7時間點,細胞核內可見顯著黃染,染色陽性區(qū)域彌漫分布于整個絨毛,陽性表達主要位于腸粘膜上皮細胞核內,胞漿內表達少,間質中的炎癥細胞也可見陽性表達。在d14時間點,0J組腸粘膜上皮細胞的胞核及胞漿內均可見明顯黃染甚至棕褐色顆粒,并呈片狀連續(xù)性、強陽性表達,整個絨毛及隱窩區(qū)內上皮細胞胞漿及胞核均可見明顯黃染,并且間質中炎癥細胞的表達量也明顯增加。而OJPUFA組的陽性表達主要位于細胞核內,也呈現彌漫性表達增強,胞漿陽性表達程度相對較弱,間質中炎癥細胞胞核及胞漿也有陽性表達。Western-blot相對定量結果顯示,Sham組大鼠NF-κb p65始終維持于極低水平,d3時間點開始,0J組和OJPUFA組NF-κb p65的含量均顯著高于假手術組,均呈現進行性升高趨勢,且以0J組變化最為顯著,在d7、14d兩個時間點,0J組小腸內NF-κb p65水平即顯著高于OJPUFA組(P=0.007,0.0000.05),這與免疫組織化學染色結果一致。4.回腸組織中HMGB1mRNA, TLR4 mRNA及NF-κb p65 mRNA的表達變化與Sham組相比,0J及OJPUFA組大鼠以上各基因表達水平明顯增加。在d3時間點,0J組與OJPUFA組相比,各基因表達水平無明顯差異。在d7、d14時間點,0J組HMGB1mRNA表達水平顯著高于OJPUFA組(P=0.010,0.0000.05)。而在d7時間點,0J組與OJPUFA組相比,TLR4 mRNA (P=0.3350.05)及NF-κbp65mRNA (P=0.5500.05)表達水平無明顯差異。隨梗阻時間延長,在14d時0J組小腸內TLR4 mRNA及NF-κb p65 mRNA表達水平即顯著高于OJPUFA組(P=0.000,0.0190.05)。結論：ω-3PUFA可改善梗大鼠阻性黃疸導致的腸絨毛高度減退,改善絨毛高度／隱窩深度比值,減弱梗阻性黃疸機體中腸粘膜上皮的損害,并可改善腸粘膜上皮中杯狀細胞的數量和功能。梗阻性黃疸可促進大鼠腸管組織中HMGB1/TLR4/NF-κB通路的活化,損害腸粘膜屏障功能；ω-3多不飽和脂肪酸可能通過抑制該通路而發(fā)揮對腸粘膜的保護作用。
【關鍵詞】：梗阻性黃疸 淋巴液 ω-3多不飽和脂肪酸 細胞因子 梗阻性黃疸 ω-3多不飽和脂肪酸 HMGB1/TLR4
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575
【目錄】：

• 中文摘要8-16
• 英文摘要16-28
• 符號說明28-29
• 研究基礎29-33
• 第一部分：ω-3PUFA干預梗阻性黃疸大鼠血液及淋巴液中細胞因子對比觀察33-63
• 前言33-34
• 材料和方法34-41
• 結果41-58
• 討論58-59
• 第一部分 附圖59-63
• 第二部分 ω-3多不飽和脂肪酸對梗阻性黃疸大鼠小腸損傷的影響及機制63-97
• 前言63-66
• 材料和方法66-77
• 結果77-81
• 討論81-86
• 結論86-87
• 第二部分 附圖及附表87-97
• 參考文獻97-110
• 致謝110-111
• 攻讀博士學位期間發(fā)表的論文情況111-112
• 學位論文評閱及答辯情況112-113
• 外文論文Ⅰ113-129
• 外文論文Ⅱ129-146

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本文編號：953747