本文關(guān)鍵詞：BCL6B基因在抑制肝細(xì)胞肝癌和肝纖維化的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究

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【摘要】：肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,目前占我國惡性腫瘤死亡原因的第二位。肝臟炎癥和肝纖維化是造成肝癌的重要因素,同時(shí)也對患者的生活質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響。肝癌,尤其是伴有肝纖維化的肝細(xì)胞肝癌,除了徹底的手術(shù)切除,目前尚缺乏其他有效的治療方法。通過基因技術(shù)手段進(jìn)行腫瘤分子標(biāo)志物的篩選和基因治療,是目前治療肝癌的研究方向和研究熱點(diǎn)。B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤6成員B (B cell CLL/lymphoma 6 member B BCL6B)基因是一個(gè)新穎的抑癌基因,最近被發(fā)現(xiàn)在胃癌中低表達(dá),然而在別的腫瘤的表達(dá)尚不清楚。研究表明,腫瘤中BCL6B基因表達(dá)量的降低與啟動子的高甲基化相關(guān),而且伴有患者術(shù)后生存時(shí)間的減少,提示BCL6B可能與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。第一部分BCL6B基因在抑制肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展及其機(jī)制研究目的：探索BCL6B在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)量改變,并驗(yàn)證其在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中的抑癌作用及機(jī)制。方法：運(yùn)用定量PCR、免疫印跡(WB)和免疫組織化學(xué)(IHC)的方法分析肝細(xì)胞肝癌與癌旁正常肝組織中BCL6B的表達(dá)水平。本研究采用肝癌細(xì)胞株HepG2與SMMC-7721細(xì)胞株,運(yùn)用慢病毒載體外源性加入重組的BCL6B,建立過表達(dá)BCL6B的細(xì)胞模型。應(yīng)用CCK-8和克隆形成試驗(yàn)檢測BCL6B對細(xì)胞增殖的影響,流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的凋亡和周期阻滯情況,Transwell試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力改變。通過裸鼠成瘤試驗(yàn)在體內(nèi)環(huán)境驗(yàn)證BCL6B的抑癌作用。通過表達(dá)譜芯片探討B(tài)CL6B抑制肝癌發(fā)生的可能機(jī)制。結(jié)果：相比正常肝細(xì)胞,7種肝癌細(xì)胞株中BCL6B的表達(dá)量出現(xiàn)了不同程度的降低。選擇肝癌細(xì)胞株HepG2與SMMC-7721過表達(dá)BCL6B,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力與細(xì)胞活性下降、細(xì)胞凋亡增多、細(xì)胞遷移和侵襲能力下降,細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BCL6B使裸鼠皮下成瘤能力明顯減弱。表達(dá)譜芯片顯示BCL6B可能通過多種信號通路途徑影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。定量PCR結(jié)果顯示,與癌旁正常肝組織相比,肝癌組織中BCL6B的mRNA的水平顯著降低(p0.01),在蛋白水平通過WB和IHC方法同樣得到了驗(yàn)證。聯(lián)系臨床病理資料分析,發(fā)現(xiàn)BCL6B的表達(dá)量與肝硬化情況呈正相關(guān)(p0.05),與門靜脈癌栓(PVTT)呈負(fù)相關(guān)(p0.05)。生存曲線表明低表達(dá)BCL6B的肝癌患者預(yù)后較差(p0.05),多因素回歸分析顯示BCL6B是肝癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。結(jié)論：BCL6B在肝癌組織中低表達(dá),與肝硬化、PVTT及患者生存率密切相關(guān)。發(fā)現(xiàn)BCL6B可能通過多途徑影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移能力。第二部分BCL6B抑制肝纖維化發(fā)生發(fā)展及其機(jī)制研究目的：驗(yàn)證BCL6B在肝纖維化組織中表達(dá)量的改變,探索BCL6B抑制肝損纖維化的機(jī)制。方法：用二乙基亞硝胺(DEN)或四氯化碳(CCl4)處理大鼠,分別造成急性肝臟損傷和慢性肝臟損傷模型。用過表達(dá)BCL6B的慢病毒或干擾BCL6B的腺病毒,分別通過門靜脈或尾靜脈注射,使大鼠肝臟過表達(dá)或低表達(dá)BCL6B。通過檢測炎癥因子和纖維化指標(biāo)分子的表達(dá)情況來驗(yàn)證BCL6B對肝臟損傷的保護(hù)作用。結(jié)果：肝纖維化的大鼠肝臟組織和慢性肝病患者肝臟組織中BCL6B的表達(dá)量,相比于正常肝臟組織均顯著增加。肝臟過表達(dá)外源性BCL6B能顯著的降低肝臟的炎癥因子和肝纖維化因子,能有效的抵抗肝臟纖維化的發(fā)生。另一方面,敲低肝臟BCL6B的表達(dá)量則加重了肝臟纖維化的發(fā)生。此外,我們發(fā)現(xiàn)BCL6B的抗纖維化作用可能是通過肝臟生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)途徑起作用的。結(jié)論：BCL6B在肝纖維組織中高表達(dá)。BCL6B有抗炎抗肝纖維化作用,而這種保護(hù)作用可能是通過HGF途徑起作用的。
【關(guān)鍵詞】：BCL6B 肝癌 預(yù)后 凋亡 BCL6B 肝纖維化 肝臟損傷 肝硬化
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7;R575.2
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-14
• 縮略詞表14-19
• 緒論19-24
• 參考文獻(xiàn)21-24
• 第一部分 BCL6B基因抑制肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生發(fā)展及其機(jī)制研究24-63
• 1 前言24-25
• 2 材料與方法25-41
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料25-27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-40
• 2.3 統(tǒng)計(jì)分析40-41
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-58
• 3.1 肝癌細(xì)胞株中BCL6B的表達(dá)水平41-42
• 3.2 檢測感染BCL6B慢病毒的過表達(dá)效率42
• 3.3 BCL6B對細(xì)胞增殖的影響42-45
• 3.4 BCL6B對細(xì)胞凋亡及周期的影響45-46
• 3.5 BCL6B對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響46-47
• 3.6 BCL6B對裸鼠成瘤能力的影響47-48
• 3.7 BCL6B抑制肝癌細(xì)胞的多種信號途徑48-51
• 3.8 BCL6B在肝癌患者組織中的差異表達(dá)51-53
• 3.9 BCL6B表達(dá)量與臨床病理特征及患者預(yù)后的相關(guān)性53-58
• 4 討論58-60
• 5 結(jié)論60-61
• 6 參考文獻(xiàn)61-63
• 第二部分 BCL6B抑制肝纖維化發(fā)生發(fā)展及其機(jī)制研究究63-93
• 1 前言63-65
• 2 材料和方法65-73
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料65-67
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法67-72
• 2.3 統(tǒng)計(jì)分析72-73
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果73-87
• 3.1 急慢性肝損傷對BCL6B的影響73
• 3.2 BCL6B減輕損傷肝臟的炎癥反應(yīng)73-77
• 3.3 BCL6B改善受損肝臟的纖維化情況77-80
• 3.4 BCL6B通過調(diào)節(jié)HGF而抑制HSCs的活化80-85
• 3.5 干擾BCL6B表達(dá)量會加重肝臟纖維化程度85-87
• 4 討論87-89
• 5 結(jié)論89-90
• 6 參考文獻(xiàn)90-93
• 綜述93-118
• 參考文獻(xiàn)105-118
• 作者簡歷及在學(xué)期間所取得的科研成果118

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本文編號：901368