本文關(guān)鍵詞：采用新一代測序技術(shù)分析不同感染階段乙型肝炎病毒準種異質(zhì)性及其臨床意義

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【摘要】：背景與目的本課題組之前采用克隆測序(CBS)的方法研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒(HBV)逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)(RT區(qū))準種異質(zhì)性可作為接受核苷類似物治療患者抗病毒療效的一個預(yù)測指標。近年來,第二代測序技術(shù)(NGS)以其相對快速、超深度、高靈敏度的特點給HBV準種研究帶來了新的策略。目前對于HBV感染后不同臨床階段的病毒全長準種異質(zhì)性的研究還未見報道。本研究應(yīng)用CBS及NGS方法擴增并獲得急性乙型肝炎(AHB)、慢性HBV攜帶(IT)、慢性乙型肝炎(CHB)、慢加急性乙型肝炎伴肝衰竭(ACLF)、代償期肝硬化(LC)患者血清病毒全長序列,結(jié)合生物信息學(xué)分析方法描述準種遺傳異質(zhì)性特征及探討其臨床意義,以期更好的闡述HBV自然史及致病機制。研究對象與方法本研究共納入97名HBV感染的患者(AHB、IT、CHB、ACLF、LC)。40例應(yīng)用CBS方法、87例應(yīng)用NGS方法(30例同時應(yīng)用兩種方法)獲得HBV全長基因組的準種后,通過生物信息學(xué)方法對準種的異質(zhì)性(復(fù)雜度和離散度)特征進行分析,并建立了NGS大數(shù)據(jù)初篩流程和質(zhì)控方法,最后分析五種不同感染階段的病毒準種異質(zhì)性、氨基酸突變指數(shù)、單個核苷酸復(fù)雜度、CP/Pre C核苷酸突變率的特點及其與臨床病程演變的相關(guān)性。結(jié)果第一部分:40例HBV感染患者,采用CBS方法,平均每名患者獲得14-17株HBV全長克隆,急性HBV感染的準種復(fù)雜度較慢性HBV感染的準種復(fù)雜度低;慢性HBV感染免疫耐受期準種復(fù)雜度低于免疫清除期;不同的免疫壓力下Core區(qū)aa60-130及X區(qū)aa131-135氨基酸變異指數(shù)(MFI)有統(tǒng)計學(xué)差異,ACLF在這些區(qū)域氨基酸突變指數(shù)大于IT及AHB,CHB次之。高突變位點集中在Core區(qū)T、B細胞表位。第二部分:87例HBV感染患者,采用Illumina Miseq高通量測序獲得30G數(shù)據(jù),經(jīng)過數(shù)據(jù)初篩獲得可分析數(shù)據(jù)20G,約12 000 000條序列進入最終分析階段。在建立高通量測序的大數(shù)據(jù)篩選流程的基礎(chǔ)上,對于高通量數(shù)據(jù)進行篩選(步驟包括:測序質(zhì)量、測序長度、序列比對優(yōu)化、PCR錯誤糾正優(yōu)化、內(nèi)參質(zhì)控評價)和生物信息學(xué)分析,每個區(qū)段豐度(除P3外)中位數(shù)為6 000(1 500-20000)。在五種不同感染階段中,IT的復(fù)雜度(Sn)和平均遺傳距離(d)最低,其次為CHB和AHB,ACLF與LC的Sn和d最高。準種的Sn和d在CHB患者中與高谷丙轉(zhuǎn)氨酶(5×ULN)、與總膽紅素(1×ULN)血癥、與ACLF預(yù)后無關(guān)。BCP/Pre C區(qū)核苷酸的分析發(fā)現(xiàn):ACLF和LC患者在CP區(qū)A1762T、G1764A、A1846T/C的變異率達到50%-90%,高于其他組(P0.001)。T1800C在感染B基因型的ACLF患者中變異率最高達46%,而在C基因型中僅有2.4%。未經(jīng)核苷類似物治療的患者病毒準種耐藥位點突變率在LC組高于其他組(1-4%vs.1%)。CBS與NGS的Sn和d相關(guān)性和一致性較差(P0.05)。綜合上述結(jié)果發(fā)現(xiàn),AHB準種異質(zhì)性在CBS研究中為最低,但是在NGS研究中高于IT及CHB準種異質(zhì)性。慢性感染患者的HBV準種復(fù)雜度與免疫壓力和感染時間有關(guān),即免疫壓力越大(ACLF),感染時間越長(LC),復(fù)雜度越高,B細胞表位對應(yīng)的氨基酸突變率(HBc Ag)越高。IT患者三年的HBV準種變化的主要發(fā)生在HBs Ag/RT區(qū)域,表現(xiàn)為突變的積累。結(jié)論本研究建立了Illumina Miseq高通量測序研究HBV準種的大數(shù)據(jù)篩選流程和質(zhì)控分析方法,發(fā)現(xiàn)在低豐度變異的檢測和準種模擬方面,Illumina Miseq描述準種異質(zhì)性的表現(xiàn)力較CBS方法更敏感、準確和高效。對HBV準種異質(zhì)性的分析可以間接反映機體免疫系統(tǒng)對病毒的應(yīng)答狀態(tài)及感染時間的長短,從而為臨床個體化抗病毒治療提供科學(xué)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：肝炎病毒 乙型 準種 Illumina Miseq PCR-克隆-測序 遺傳異質(zhì)性 突變率指數(shù)
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.62
【目錄】：

• 摘要5-7
• abstract7-9
• 縮寫/符號說明9-12
• 緒論12-15
• 第一部分 采用PCR-克隆-測序（CBS）方法分析不同感染階段HBV全長準種異質(zhì)性及其臨床意義15-51
• 引言16-21
• 研究對象與方法21-35
• 結(jié)果35-46
• 討論46-50
• 結(jié)論50-51
• 第二部分 采用Illumina Miseq （NGS）方法分析不同感染階段HBV準種異質(zhì)性及其臨床意義51-113
• 引言52-58
• 研究對象與方法58-76
• 結(jié)果76-106
• 討論106-112
• 結(jié)論112-113
• 展望113-115
• 參考文獻115-124
• 致謝124-127
• 附錄127-147
• 攻讀學(xué)位期間取得的主要成績147-148

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;慢性乙型肝炎防治指南[J];中華傳染病雜志;2005年06期

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本文編號：860089