本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療潰瘍性結(jié)腸炎及復(fù)方苦參湯的協(xié)同作用研究

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【摘要】：第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定 目的：全骨髓貼壁法體外分離培養(yǎng)及鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。 方法：取4周齡SD大鼠,體外分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)連續(xù)傳代純化,流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣形態(tài),梭形或紡錘形,漩渦狀或輻射狀排列,P3代及以后的細(xì)胞形態(tài)均一,生長(zhǎng)旺盛,無(wú)明顯衰老現(xiàn)象。BMSCs高表達(dá)CD29. CD90,而不表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記CD45, CD11b。 結(jié)論：全骨髓貼壁法體外分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)均勻、狀態(tài)穩(wěn)定,純度高,形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞學(xué)鑒定符合間充質(zhì)干細(xì)胞特點(diǎn)。 第二部分BMSCs移植治療潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的實(shí)驗(yàn)研究及復(fù)方苦參湯的干預(yù) 目的：BMSCs移植及復(fù)方苦參湯干預(yù)后,觀察實(shí)驗(yàn)大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index, DAI),結(jié)腸病理組織學(xué)改變并評(píng)分。 方法：8周齡清潔級(jí)SD大鼠,采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎模型；慢病毒(Lentiviral Vector, LV)介導(dǎo)綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)轉(zhuǎn)染BMSCs;標(biāo)記后的BMSCs于造模后進(jìn)行移植,同時(shí)以復(fù)方苦參湯灌胃干預(yù)；免疫熒光組化及weston blot檢測(cè)結(jié)腸組織GFP表達(dá),對(duì)各組大鼠進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)估,并觀察結(jié)腸組織病理學(xué)改變進(jìn)行評(píng)分。 結(jié)果：1、BMSCs移植及復(fù)方苦參湯干預(yù)2w后,免疫熒光組化及weston blot顯示,BMSCs組和二聯(lián)組結(jié)腸炎性受損區(qū)可見(jiàn)GFP表達(dá)；2、與空白組相比,PBS組的DAI評(píng)分顯著上升,與PBS組相比,BMSCs組和二聯(lián)組能夠下降DAI分?jǐn)?shù)(P0.05);3、與空白組相比,PBS組的組織病理學(xué)評(píng)分顯著增加,與PBS組相比,BMSCs組及二聯(lián)組的評(píng)分下降(P0.05)。 結(jié)論：BMSCs和復(fù)方苦參湯干預(yù)后結(jié)腸炎大鼠癥狀得到了明顯的緩解,結(jié)腸組織受損得到修復(fù)。 第三部分BMSCs治療潰瘍性結(jié)腸炎的免疫機(jī)制研究 目的：研究BMSCs治療潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)免疫作用機(jī)制 方法：體外分離培養(yǎng)BMSCs,流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定,LV-GFP轉(zhuǎn)染BMSCs進(jìn)行標(biāo)記,TNBS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型,實(shí)驗(yàn)分為四組：空白組,PBS組,BMSCs組,BMSCs組+中藥組。PBS/BMSCs經(jīng)尾靜脈移植,BMSCs組+中藥組予復(fù)方苦參湯灌胃干預(yù),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)大鼠外周血Treg表達(dá),ELISA檢測(cè)大鼠血清TNF-a表達(dá),Western blot檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核NF-κBp65表達(dá),RT-PCR檢測(cè)大鼠腸黏膜Foxp3mRNA TNF-αmRNA的表達(dá)。 結(jié)果：1、和空白組相比,PBS組外周血Treg比率明顯下降;干預(yù)后,和PBS組相比,BMSCs和二聯(lián)組Treg比率上升(P0.05)。2、和空白組相比,PBS組Foxp3mRNA表達(dá)明顯上升;干預(yù)后,和PBS組相比,BMSCs和二聯(lián)組Foxp3mRNA表達(dá)下降(P0.05)。3、和空白組相比,PBS組胞質(zhì)及胞核NF-k Bp65表達(dá)升高；干預(yù)后,和PBS組相比,BMSCs和二聯(lián)組胞質(zhì)及胞核NF-k Bp65表達(dá)下降(P0.05)。4、和空白組相比,PBS組TNF-a表達(dá)升高；干預(yù)后,和PBS組相比,BMSCs和二聯(lián)組TNF-a表達(dá)明顯下降(P0.05)。 結(jié)論：BMSCs可以有效緩解潰瘍性結(jié)腸炎,機(jī)制可能與BMSCs重新調(diào)配外周血和腸黏膜之間的Γreg比例,以及調(diào)控NF-kB介導(dǎo)的促炎反應(yīng)相關(guān),同時(shí)復(fù)方苦參湯起到協(xié)同作用。
【關(guān)鍵詞】：全骨髓貼壁法 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 傳代 LV-GFP TNBS DAI 組織病理學(xué) BMSCs 復(fù)方苦參湯 Treg NF-κB TNF-α
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R574.62
【目錄】：

• 英文縮略詞表8-11
• 研究背景11-13
• Background13-15
• 中文摘要15-18
• Abstract18-22
• 第一部分 BMSCs的體外分離、培養(yǎng)及鑒定22-35
• 前言22
• 材料和方法22-27
• 一、實(shí)驗(yàn)材料22-24
• 二、實(shí)驗(yàn)方法24-27
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-29
• 一、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察27-28
• 二、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的流式鑒定28-29
• 討論29-32
• 參考文獻(xiàn)32-35
• 第二部分 BMSCs移植治療潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的實(shí)驗(yàn)研究及復(fù)方苦參湯的干預(yù)35-55
• 前言35-36
• 材料和方法36-44
• 一、實(shí)驗(yàn)材料36-37
• 二、實(shí)驗(yàn)方法37-44
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-48
• 一、動(dòng)物模型評(píng)估及DAI評(píng)分44-45
• 二、追蹤體內(nèi)干細(xì)胞45-46
• 三、組織病理學(xué)觀察46-47
• 四、組織病理學(xué)評(píng)分47-48
• 討論48-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 第三部分 BMSCs治療潰瘍性結(jié)腸炎的免疫機(jī)制研究55-82
• 前言55
• 材料和方法55-65
• 一、實(shí)驗(yàn)材料55-57
• 二、實(shí)驗(yàn)方法57-65
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果65-70
• 一、實(shí)驗(yàn)大鼠外周血CD4~+D25~+Foxp3~+Treg細(xì)胞表達(dá)65-67
• 二、大鼠血清TNF-Q表達(dá)67-68
• 三、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核NF-κ Bp65表達(dá)68-69
• 四、實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸黏膜Foxp3、TNF-α mRNA表達(dá)69-70
• 討論70-76
• 參考文獻(xiàn)76-82
• 綜述82-90
• 參考文獻(xiàn)86-90
• 附件一 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文90-91
• 附件二 攻讀學(xué)位期間參與科研課題91-92
• 致謝92

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