本文關(guān)鍵詞：基于腺相關(guān)病毒載體的人工miRNA抗乙型肝炎病毒基因治療研究

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【摘要】：乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)引起的傳染病。HBV感染是一個非常嚴重的全球性公共衛(wèi)生問題,是嚴重危害人類健康的重大傳染病之一。據(jù)統(tǒng)計,全球大約有3.5億慢性HBV感染者,每年全球大約有100萬人死于與HBV感染相關(guān)的疾病,包括肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌等。中國是乙型病毒性肝炎的高流行地區(qū),人群感染率高,在某些地區(qū)感染率高達35%以上,給國家?guī)沓林氐纳鐣?jīng)濟負擔。我國HBV攜帶者約9300萬人,其中慢性乙肝患者高達2500萬,是我國最為嚴重的三大傳染病之一,也是我國肝細胞癌(HCC)高發(fā)的重要原因。目前臨床上對乙肝病毒感染的主要治療藥物包括干擾素、核苷及核苷酸類似物等,但是這些藥物只能在少數(shù)慢性感染患者中產(chǎn)生長期應(yīng)答,并不能徹底清除乙肝病毒,并且也存在著復(fù)發(fā)率高、藥物毒副作用較大和藥品價格昂貴等問題,因此發(fā)展慢性乙肝新的治療策略仍是醫(yī)學上面臨的巨大挑戰(zhàn)�；蛑委熥鳛樯锛夹g(shù)新的里程碑,是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主方向之一,曾被Science雜志評為2009年10大科學突破之一,而其中值得關(guān)注的是,重組腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)載體在治療先天性黑蒙病中及B型血友病等疾病的基因治療臨床試驗中取得了突破性的進展,第一個用于治療脂蛋白脂酶缺乏遺傳病(LPLD)的AAV載體介導(dǎo)的基因治療藥物Glybera已在歐美國家批準上市。AAV以其低致病性、低免疫原性、能導(dǎo)致外源基因長期表達等優(yōu)點被視為最具有開發(fā)潛質(zhì)的病毒載體之一。而根據(jù)多篇文章報道,在眾多AAV血清型中,8型腺相關(guān)病毒(AAV-8)對肝臟細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高,是肝臟疾病基因治療常用載體。miRNA是一類由內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄加工形成的長約21 nt的小分子單鏈RNA,是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)Dicer酶加工后生成,在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達調(diào)控。人工miRNA (artificial miRNA, amiRNA)是指將天然miRNA的成熟序列替換為人工設(shè)計的靶向某一基因的反義序列,可模擬內(nèi)源miRNA的作用機制人為地沉默目的基因,由于amiRNA利用了miRNA的天然生成途徑,同時相對于shRNA具有干擾效果更好、體內(nèi)毒性更低等優(yōu)點而逐漸成為研究的新熱點。本課題應(yīng)用8型腺相關(guān)病毒載體攜帶三個串聯(lián)表達的amiRNA進行抗HBV的基因治療研究。本課題第一部分探索了應(yīng)用肝靶向性較好的AAV-8載體介導(dǎo)3個串聯(lián)表達的amiRNA對乙肝模型小鼠體內(nèi)HBV抑制作用的研究。本課題組成員在前期研究中構(gòu)建了3條靶向不同基因型HBV的基因組保守區(qū)并去除任何靶向人和小鼠非特異序列的amiRNA,實驗證明其對HBsAg和HBeAg勻有顯著的抑制效果且3個串聯(lián)表達的amiRNA較單個的amiRNA有更高的抑制HBV復(fù)制的作用。本研究中,我們構(gòu)建了攜帶肝特異性啟動子的3個串聯(lián)amiRNA的rAAV表達質(zhì)粒并命名為pAAV-liver-amiRNA135,通過將pAAV-liver-amiRNA135與不同基因型HBV表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細胞,在體外證明其對不同基因型HBV的HBsAg、HBeAg的表達以及HBV DNA的復(fù)制均有顯著抑制作用(p0.01)。接著,我們將pAAV-liver-amiRNA135包裝成與質(zhì)粒相比對肝臟細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高的重組腺相關(guān)病毒載體即AAV8-amiRNA135,然后對其進行藥效學評價,為后期較深入的臨床前研究和臨床研究提供參考。首先,我們利用乙肝病毒低復(fù)制轉(zhuǎn)基因小鼠聯(lián)合水動力注射HBV表達質(zhì)粒以維持小鼠肝內(nèi)HBV長期高復(fù)制表達的方法構(gòu)建了肝內(nèi)HBV高復(fù)制的乙肝模型鼠并進行AAV8-amiRNA135的梯度藥效學實驗。將AAV8-amiRNA135以5×1011vg/只、5×1010vg/只、5×109vg/只、5×108vg/只經(jīng)尾靜脈分別注射模型小鼠,并以注射5×1011vg/只攜帶不靶向人類及老鼠任何基因的amiRNA序列的AAV8-Neg為陰性對照組,以注射5×1011vg/只攜帶雙熒光素酶基因的AAV8-luc載體為空白對照組,在注射后不同時間點內(nèi)采靜脈血,用定量ELISA方法檢測血清中HBsAg及HBeAg的表達水平,結(jié)果顯示,AAV8-amiRNA135對乙肝模型小鼠血清HBsAg及HBeAg的抑制效果具有劑量依賴性,尤其是注射5×1011vg/只AAV8-amiRNA135的乙肝模型小鼠血清中HBsAg、 HBeAg;表達水平顯著下降,甚至接近陰性水平。更重要的是,我們發(fā)現(xiàn)單次尾靜脈注射AAV8-amiRNA135能有效抑制HBV復(fù)制至少15個月。接著,我們通過頸椎脫臼法處死小鼠,提取肝臟組織乙肝病毒核心顆粒DNA來檢鋇HBV DNA的拷貝數(shù)水平,結(jié)果顯示,肝臟組織中HBVDNA拷貝數(shù)隨著該病毒載體注射劑量的增大而顯著降低(p0.01),說明了amiRNA135的表達能有效抑制肝內(nèi)HBVDNA的復(fù)制。此外,我們對肝臟組織進行了HE染色及針對乙肝表面抗原HBsAg和核心抗原HBcAg的免疫組織化學染色。HE染色結(jié)果顯示,陰性對照組小鼠肝組織切片可見明顯炎癥細胞浸潤,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝炎病理特征較明顯；注射5×109vg AAV8-amiRNA135小鼠肝臟組織與陰性對照組相比,炎癥細胞相對較少,有較為整齊的肝小葉結(jié)構(gòu)；注射劑量為5×1010vg及5×1011vgAAV8-amiRNA135的小鼠,肝細胞形態(tài)正常,肝小葉排列整齊且無明顯炎癥細胞浸潤,說明注射劑量為5x1010vg及5×1011Vg的AAV8-amiRNA135能有效抑制肝炎反應(yīng)且無明顯肝毒性。通過免疫組織化學染色法檢測肝臟組織中HBsAg和HBcAg的表達水平,結(jié)果顯示,肝臟組織中HBsAg和HBcAgP陽性細胞數(shù)均隨著AAV8-amiRNA135注射劑量的增大而減少,說明AAV8-amiRNA135對乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中HBsAg,及HBcAg的表達均有顯著抑制作用,且抑制效果具有劑量依賴性。后續(xù)隨著實驗室高復(fù)制乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠模型的成功構(gòu)建,我們進一步研究比較了AAV8-amiRNA135對不同品系的高復(fù)制乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠的抗HBV作用。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠選擇了三個品系,分別為C16-4♀、2C♂和2B♂、2B♀。將AAV8-amiRNA135以5×10¨vg/只經(jīng)尾靜脈分別注射以上小鼠,以注射5×1011vg/只的AAV8-Neg為陰性對照組,在注射后第1、2、3周采靜脈血檢測血清中HBsAg及HBeAg的表達水平,結(jié)果顯示,AAV8-amiRNA135對三個品系的乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠均有較好的抑制作用,其對血清中HBsAg的抑制效率均達到80%-90%,對HBeAg的抑制效率也達到40%-70%。注射病毒載體后第4周,通過頸椎脫臼法處死小鼠,對肝臟組織HBV DNA及HBV RNA拷貝數(shù)水平進行定量檢測,結(jié)果顯示,注射AAV8-amiRNA135的乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中HBV DNA及HBV RNA拷貝數(shù)均顯著低于陰性對照組(p0.05),說明了amiRNA135的表達能有效抑制不同品系乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟組織中HBVDNA及RNA的復(fù)制。綜上所述,這一部分研究所構(gòu)建的AAV8-amiRNA135載體對HBV具有廣泛而顯著的抑制作用,且單次載體灌注能有效發(fā)揮抑制作用至少15個月,本研究結(jié)果為慢性乙肝的基因治療開辟了新路徑。為進一步提高AAV介導(dǎo)的肝臟疾病基因治療效率,本課題第二部分和第三部分內(nèi)容旨在探索肝靶向性更高的重組腺相關(guān)病毒載體。在目前發(fā)現(xiàn)的眾多AAV血清型中,已知AAV-8是肝臟基因治療最常用的載體之一；AAV-DJ是將8種不同血清型AAV的衣殼基因通過DNA shuffling技術(shù)得到的嵌合型AAV載體,具有與AAV-8相同的肝靶向性且人體內(nèi)存在的AAV抗體對它的中和性較低,因此也被認為是人類肝臟疾病基因治療理想的載體之一。但盡管如此,AAV在肝臟基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的應(yīng)用還具有一定的挑戰(zhàn)性,例如,機體對AAV衣殼蛋白的免疫排斥、泛素蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解途徑均能使AAV在細胞內(nèi)發(fā)生降解,從而降低其介導(dǎo)的基因傳遞效率。因此,為了降低AAV的免疫源性及胞內(nèi)降解率,需要進一步優(yōu)化AAV載體,從而提高其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。據(jù)文獻報道,對AAV衣殼蛋白表面特定的磷酸化/泛素化殘基(如酪氨酸,賴氨酸,絲蘇氨酸等)進行突變能進一步提高其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,原因是這些位點突變后能阻斷下游的泛素化介導(dǎo)的蛋白降解,從而提高AAV載體介導(dǎo)外源基因在細胞內(nèi)的表達效率。我們首先利用磷酸化/泛素化位點預(yù)測軟件,選定了三個AAV8的突變位點和三個AAV-DJ的突變位點,然后利用overlap-PC R方法進行定點突變,構(gòu)建了三個AAV8的突變體：Y447F、Y703F和Y708F,以及三個AAV-DJ的突變體：K137,T251A, S503A。通過PEI轉(zhuǎn)染法將突變的cap質(zhì)粒、病毒包裝輔助質(zhì)粒pAAV-Helper及外源基因表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝成表達GFP基因和/或雙熒光素酶Gluc-Fluc基因的重組AAV載體。首先將表達雙熒光素酶Gluc-Fluc基因的重組野生型AAV-8及其三個酪氨酸突變體(Y447F、Y703F和Y708F)以1×1010vg注射6-8周齡的C57BL/6小鼠,在注射后第7、14、21、28天取尾靜脈血檢鋇Gluc的表達,結(jié)果顯示,Y703F突變體介導(dǎo)Gluc的相對表達量在不同時間點均顯著高于野生型AAV8約3-4倍(P0.05)。注射42天后麻醉小鼠,利用活體成像方法檢測各載體的體內(nèi)靶向性,結(jié)果顯示,三種突變體均具有肝靶向性,與野生型AAV-8一致,且Y703F介導(dǎo)的Fluc在肝臟組織中的平均光強度顯著高于野生型AAV-8約2倍(P0.01)�；铙w成像實驗后處死小鼠,提取各組織DNA,調(diào)整上樣DNA模板至相同濃度,用QPCR方法檢測Fluc DNA的水平,結(jié)果顯示,在肝臟組織中,四種載體介導(dǎo)的Fluc DNA拷貝數(shù)在106～107GC (genomecopy) /100ng總DNA,而在其他組織,例如腎臟、心臟及肌肉組織,四種載體介導(dǎo)的Fluc的DNA拷貝數(shù)則低至105～106GC/100ng ,總DNA,進一步說明了三個酪氨酸突變體的肝靶向性沒有改變,而且Y703F突變體介導(dǎo)的Fluc對小鼠肝臟、腎臟及肌肉的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率均高于野生型AAV-8約3-7倍(P0.01)。為了進一步驗證該突變體的有效性,我們還比較了攜帶治療性基因血管緊張素1-7 (Angiotemin 1-7 ,Ang (1-7))的wtAAV-8及其Y703F突變體在C57BL/6小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,將兩種病毒以1×1011vg經(jīng)尾靜脈分別注射小鼠,以注射1×1011vg Y703F-Luc為陰性對照組,在注射后第7,14,21,28天檢測血清中Ang(1-7)的表達水平,結(jié)果顯示,Y703F介導(dǎo)的Ang(1-7)表達水平從第14天開始顯著高于wtAAV-8約2倍(p0.01)；肝組織DNA拷貝數(shù)分析結(jié)果顯示,Y703F介導(dǎo)的Ang(1-7)在肝臟的DNA拷貝數(shù)顯著高于wtAAV-8約3倍(p0.001)。因此我們得出,對AAV-8衣殼蛋白703位點上的酪氨酸殘基進行突變能有效提高其對肝臟的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,且該突變體具有與wtAAV-8相一致的肝靶向性。同樣地,我們將表達雙熒光素酶Gluc- F luc基因的AAV-DJ及其三個突變體(K137R, T251A, $503A)以l×1011vg注射6-8周齡的C57BL/6小鼠,在注射后第7、14、21、28天取尾靜脈血檢鋇Gluc的表達,結(jié)果顯示,S503A突變體介導(dǎo)Gluc的相對表達量在不同的時間點均高于AAV-DJ約3倍(P0.01)。注射42天后麻醉小鼠,利用活體成像方法檢測各載體的體內(nèi)靶向性,結(jié)果顯示,三種突變體均具有肝靶向性,與AAV-DJ一致�；铙w成像實驗后處死小鼠,提取各組織DNA,調(diào)整上樣DNA模板至相同濃度,用QPCR方法檢鋇Fluc DNA的水平,結(jié)果顯示,在肝臟組織中,四種載體介導(dǎo)的Fiuc的DNA拷貝數(shù)在107～108 GC/100ng總DNA,而在腎臟、心臟、胰臟、肺、腦及肌肉組織,四種病毒載體介導(dǎo)的Fluc的DNA拷貝數(shù)則低至105～107 GC/100ng總DNA,進一步說明了三個突變體仍保持肝靶向性,而且S503A突變體介導(dǎo)的Fluc對小鼠肝臟、心臟及肌肉的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率均顯著高于AAV-DJ約3倍(P0.05)。然而,在體外實驗中,我們將表達GFP基因的AAV-DJ及其三個突變載體以MOI=1000感染三種不同類型的細胞：293T、Hela和HepG2細胞,感染后48h檢測四種病毒載體介導(dǎo)GFP對三種不同細胞系的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,結(jié)果顯示,K137R和S503A突變體介導(dǎo)的GFP對三種細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率稍高于AAV-DJ約20%-30%(p0.05),而T251A突變體則無明顯差異。因此我們得出,雖然體外感染效率只有稍微的提高,但AAV-DJ衣殼蛋白503位點上的絲氨酸殘基進行突變能夠有效提高其對小鼠體內(nèi)肝臟、心臟及肌肉的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,具有重要應(yīng)用意義。綜合本課題的三部分研究內(nèi)容,我們主要取得了以下成果：1、本研究所研發(fā)的AAV8-amiRNA具有自主知識產(chǎn)權(quán),實驗證明該候選藥物能在乙肝模型動物體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地表達,從而達到長期穩(wěn)定抑制HBV復(fù)制的作用。利用AAV-8作為載體攜帶3個串聯(lián)表達的amiRNA在乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)表達,能有效抑制小鼠血清中HBsAg, HBeAg水平并顯著降低肝臟HBsAg、HBcAg的表達水平以及HBVRNA, DNA的拷貝數(shù)；一次尾靜脈注射能穩(wěn)定發(fā)揮抑制作用至少15個月；對不同品系乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠均具有廣泛而顯著的抑制作用,該候選藥物為乙肝的基因治療開辟了新路徑；2、通過overlapping-PCR方法對AAV-8衣殼蛋白進行單點突變,構(gòu)建了三個AAV8的酪氨酸突變體(Y447F、Y703F、Y708F),體內(nèi)結(jié)果顯示,Y703F突變能顯著提高其對小鼠肝臟、腎臟及肌肉的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率且具有與wtAAV-8一致的肝靶向性；3、同樣方法構(gòu)建了三個AAV-DJ的突變體(K137R、 T251A, S503A),雖然體外結(jié)果顯示四個病毒載體對293T、Hela及HepG2細胞的感染效率差異較小,但體內(nèi)結(jié)果顯示,S503A突變能顯著提高其對小鼠肝臟、心臟及肌肉的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率,且同樣具有較好的肝靶向性。以上結(jié)果為肝臟疾病的基因治療提供新線索。
【關(guān)鍵詞】：重組腺相關(guān)病毒載體 點突變 人工miRNA 乙肝 基因治療
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R512.62;R450
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-34
• 參考文獻27-34
• 第一章 AAV8介導(dǎo)amiRNA抑制乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV復(fù)制34-68
• 1.1 實驗材料35-37
• 1.2 實驗方法37-47
• 1.3 統(tǒng)計學分析47-48
• 1.4 實驗結(jié)果48-63
• 1.5 討論63-65
• 1.6 參考文獻65-68
• 第二章 衣殼蛋白表面磷酸化位點突變提高AAV-8的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率68-91
• 2.1 實驗材料69-70
• 2.2 實驗方法70-78
• 2.3 統(tǒng)計學分析78
• 2.4 實驗結(jié)果78-86
• 2.5 討論86-88
• 2.6 參考文獻88-91
• 第三章 衣殼蛋白表面磷酸化位點突變提高AAV-DJ的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率91-113
• 3.1 實驗材料91-93
• 3.2 實驗方法93-101
• 3.3 統(tǒng)計學分析101
• 3.4 實驗結(jié)果101-109
• 3.5 討論109-111
• 3.6 參考文獻111-113
• 全文總結(jié)113-115
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文115-116
• 英文縮寫116-117
• 致謝117-118

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1 劉麗玉;睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建[D];福建醫(yī)科大學;2005年

2 陳鯉敏;睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子和綠色熒光蛋白共表達的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建[D];福建醫(yī)科大學;2009年

3 林世斌;大鼠生長相關(guān)蛋白基因重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建[D];福建醫(yī)科大學;2006年

4 阮景明;激肽釋放酶腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及其在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中的表達[D];福建醫(yī)科大學;2004年

5 藍丹鋒;GAP-43和紅色熒光蛋白融合基因重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及表達[D];福建醫(yī)科大學;2006年

6 袁亞麗;靶向14-3-3ζ基因siRNA的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建與表達[D];華南理工大學;2011年

7 陳曉斌;重組人HIF-1α反義RNA腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建和鑒定[D];福建醫(yī)科大學;2007年

8 陳德杰;人Angiopoietin1和VEGF基因AAV共表達系統(tǒng)的構(gòu)建[D];武漢大學;2004年

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本文編號：826400