本文關鍵詞：失代償性肝硬化患者骨髓間充質干細胞對T淋巴細胞的免疫調節(jié)作用

  更多相關文章： 肝硬化 骨髓間充質干細胞 培養(yǎng) 生物學特性 肝硬化 骨髓間充質干細胞 Treg Th17 Treg/Th17 IL-10 TGF-β1

【摘要】：第一部分:失代償性肝硬化患者骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)及其生物學特性的研究目的:建立失代償性肝硬化患者骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)體外培養(yǎng)體系,并探討其生物學特性。方法:采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法相結合,培養(yǎng)基為含自體血清間充質干細胞培養(yǎng)基,從失代償性肝硬化患者骨髓中分離培養(yǎng)間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs),觀察骨髓MSCs的培養(yǎng)成功率、原代培養(yǎng)時間,測定生長曲線,流式細胞儀分析鑒定MSCs的純度。結果:失代償性肝硬化患者BMSCs的體外分離培養(yǎng)成功率100%(9/9);BMSCs的原代培養(yǎng)時間為(13.0±2.3)天,傳代培養(yǎng)時間(8.4±1.7)天;BMSCs具有相似的形態(tài),均呈梭形,成纖維細胞樣細胞,P3代骨髓間充質干細胞的純度可達95%,其高表達CD44(95.01%)、CD29(92.79%),低表達CD34(1.31%)、CD45(1.08%),符合MSCs的免疫學特征。結論:肝硬化患者來源的MSCs具有MSCs的共同生物學特性,使用自體血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)的肝硬化患者BMSCs生長穩(wěn)定,增殖旺盛,能連續(xù)傳代,可能是替代原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT)的理想的“種子細胞”。第二部分:失代償性肝硬化患者骨髓間充質干細胞對T淋巴細胞的免疫調節(jié)作用目的:探討失代償期乙型肝炎肝硬化患者骨髓MSCs對自體外周血T淋巴細胞的免疫調節(jié)作用。方法:分離失代償性肝硬化患者外周血淋巴細胞行羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(carboxy-fluorescein diacetate succinimidyl ester,CFDA SE)熒光染色,在植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)刺激下,培養(yǎng)基為自體血清,自體外周血淋巴細胞與P3代BMSCs共培養(yǎng),實驗分四組:①BMSCs+淋巴細胞+PHA接觸培養(yǎng)組;②BMSCs+淋巴細胞+PHA非接觸培養(yǎng)組;③淋巴細胞+PHA陽性對照組;④單獨淋巴細胞陰性對照組。流式細胞術檢測各組淋巴細胞增殖情況和CD4+CD25+CD127-調節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Tregs)及CD4+CD8-IL-17+輔助性T細胞17(T helper 17 cell,Th17)細胞頻數(shù),逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測BMSCs的白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)及轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)m RNA表達水平。結果:流式細胞術顯示:1.接觸培養(yǎng)組及非接觸培養(yǎng)組的細胞增殖較陽性對照組明顯減低(P0.01),但亦顯著高于陰性對照組(P0.01),其組間比較,淋巴細胞增殖無顯著差異(P0.05);2.接觸培養(yǎng)組及非接觸培養(yǎng)組Tregs細胞頻率顯著高于陽性及陰性對照組(P0.01),但其組間比較Tregs頻數(shù)無顯著差異(P0.05);3.接觸培養(yǎng)組及非接觸培養(yǎng)組的Th17細胞頻率顯著高于陰性對照組(P0.01),但低于陽性對照組(P0.01),其組間比較亦無顯著差異(P0.05);4.培養(yǎng)前后組內比較:接觸培養(yǎng)組及非接觸培養(yǎng)組Treg/Th17比率均明顯上調(P均0.01),而陽性及陰性對照組變化不明顯(P均0.05)。培養(yǎng)后組間比較,接觸培養(yǎng)組及非接觸培養(yǎng)組Treg/Th17比率顯著高于陽性及陰性對照組(P均0.01),其組間比較亦無顯著差異(P0.05)。RT-PCR實驗結果顯示:培養(yǎng)前后組內比較,培養(yǎng)后接觸培養(yǎng)組及非接觸培養(yǎng)組TGF-β1 m RNA和IL-10m RNA相對水平均顯著高于培養(yǎng)前(P均0.01);培養(yǎng)后組間比較,接觸培養(yǎng)組及非接觸培養(yǎng)組TGF-β1 m RNA和IL-10m RNA相對水平均無顯著差異(P0.05)。結論:失代償期乙型肝炎肝硬化患者的骨髓MSCs可抑制自體淋巴細胞增殖,顯著上調Tregs表達,并改善Treg/Th17失衡,其免疫調節(jié)機制可能與分泌抑制性細胞因子IL-10、TGF-β1有關。
【關鍵詞】：肝硬化 骨髓間充質干細胞 培養(yǎng) 生物學特性 肝硬化 骨髓間充質干細胞 Treg Th17 Treg/Th17 IL-10 TGF-β1
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-12
• 第一部分 失代償性肝硬化患者骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)及其生物學特性的研究12-20
• 一、材料12-13
• 二、方法13-15
• 三、結果15-17
• 四、討論17-20
• 第二部分 失代償性肝硬化患者的骨髓間充質干細胞對T淋巴細胞的免疫調節(jié)作用20-38
• 一、材料20-21
• 二、方法21-26
• 三、結果26-33
• 四、討論33-38
• 參考文獻38-44
• 全文總結44-45
• 綜述45-56
• 參考文獻51-56
• 英文縮略詞表56-57
• 攻讀學位期間公開發(fā)表的論文57-58
• 致謝58-59

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：669878