本文關(guān)鍵詞：血清類胰島素生長因子IGF-1和肝組織IGF-1R在肝硬化病理過程中的表達

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【摘要】：研究背景:肝硬化是一種常見的消化系統(tǒng)疾病,常常繼發(fā)于多種慢性肝臟疾病,以肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,殘余肝組織結(jié)節(jié)樣增生以及肝纖維組織增生為主要病理學(xué)特征。肝硬化嚴重危害著人類的健康,每年有上百萬人死于肝硬化及相關(guān)并發(fā)癥。在西方發(fā)達國家,肝硬化的主要病因為丙型病毒性肝炎,酒精性肝炎以及非酒精性脂肪肝,而在亞撒哈拉以及亞洲大部分地區(qū)乙型病毒性肝炎則是肝硬化的主要病因。大量證據(jù)表明,肝硬化能夠增加肝細胞癌的發(fā)病風險,是肝癌發(fā)生的獨立危險因素,然而肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)變的具體機制尚不十分明確。類胰島素生長因子I(IGF-1)是一種體內(nèi)重要的生長刺激因子,能夠通過自分泌、旁分泌以及內(nèi)分泌等途徑作用于其受體,促進組織和器官的生長及發(fā)育。正常生理情況下,體內(nèi)超過90%的IGF-1均是由肝組織合成和分泌的,雖然身體很多其他器官也能夠合成,但只占很小的比例。研究表明IGF-1能夠促進包括肝癌的多種癌癥細胞的增值,此外IGF-1的主要受體類胰島素生長因子受體I(IGF-1R)在包括肝癌的多種腫瘤組織中表達上調(diào),并于腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移性、對放化療的敏感性以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。雖然已經(jīng)證實IGF-1/IGF-1R對肝癌的發(fā)生發(fā)展有著較為明確的促進作用,但是IGF-1/IGF-1R在肝硬化病理過程中的變化及與肝癌發(fā)生的關(guān)系卻尚不十分明確,有文獻報道肝硬化患者血清IGF-1濃度較正常人有所降低,這似乎與IGF-1對腫瘤發(fā)生發(fā)展的促進作用相矛盾。本實驗主要通過實驗證實肝硬化時血清IGF-1與肝組織IGF-1R表達的變化,并進一步探討引起二者變化的內(nèi)在調(diào)控機制,為解釋肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)變的具體機制提供進一步的理論支持。1.肝硬化對血清IGF-1的影響及引起變化的可能原因建立四氯化碳小鼠肝硬化模型,整個造模周期共12周。收集臨床肝硬化患者與非肝硬化患者血清標本。應(yīng)用試劑盒法檢測小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST的變化;對小鼠肝組織石蠟切片進行HE染色和Masson染色檢驗肝硬化小鼠造模是否成功;應(yīng)用ELISA(Enzyme linked Immunosorbent Assay)試劑盒檢測小鼠及患者血清IGF-1濃度的變化;測量小鼠肝重和體重,計算并比較各組實驗小鼠肝指數(shù)及脾指數(shù)。實驗結(jié)果表明四氯化碳肝硬化小鼠模型第1周和第4周主要表現(xiàn)為急性肝損傷,表現(xiàn)為肝組織局灶性壞死及肝細胞的空泡樣變性,血清轉(zhuǎn)氨酶AST及ALT明顯升高。第8周時纖維組織明顯增生,組織病理學(xué)表現(xiàn)出部分肝硬化的特征,出現(xiàn)明顯的肝纖維組織增生形成的條索。第12周肝硬化模型建立成功,肝臟大體標本可見突出肝表面的結(jié)節(jié),纖維組織進一步增生,整個造模過程中血清轉(zhuǎn)氨酶AST與AST均有明顯的升高。ELISA檢測小鼠血清IGF-1提示造模組第12周血清IGF-1明顯降低,ELISA法檢測臨床患者血清IGF-1提示肝硬化患者血清IGF-1明顯低于對照組,證明肝硬化能夠引起血清IGF-1濃度的降低。通過對比第8周及第12周造模組小鼠肝指數(shù)發(fā)現(xiàn),第12周小鼠肝指數(shù)明顯降低,說明肝實質(zhì)發(fā)生萎縮。以上結(jié)果推測肝硬化時血清IGF-1濃度的降低主要可能是由肝實質(zhì)的萎縮引起肝臟合成功能的下降引起。2.肝硬化時肝組織IGF-1R表達水平的變化及其引起變化的可能原因收集上述實驗小鼠肝組織標本以及臨床肝硬化患者與非肝硬化患者肝組織石蠟切片。對實驗小鼠及臨床患者肝組織石蠟切片進行IGF-1R的免疫組織化學(xué)染色;以GAPDH為內(nèi)參應(yīng)用Western-blot法檢測小鼠肝組織IGF-1R蛋白的表達;以GAPDH為內(nèi)參應(yīng)用Western-blot法檢測IRS-1,AKT蛋白和GSK-3β,FOXO3a蛋白以及相應(yīng)磷酸化形式蛋白表達水平并進行分析。小鼠肝組織石蠟切片免疫組織化學(xué)染色以及小鼠肝組織IGF-1R的Western-blot檢測提示第12周造模組小鼠肝組織IGF-1R表達明顯上調(diào),臨床患者肝組織石蠟切片提示肝硬化患者肝組織IGF-1R的表達明顯高于非肝硬化患者。小鼠肝組織Western-blot結(jié)果提示造模組第12周小鼠肝組織p-IRS-1和p-AKT表達水平下降,證明IRS-1和AKT蛋白激活程度降低;另一方面,p-GSK-3β和p-FOXO3a表達水平降低,p-GSK-3β/GSK-3β和p-FOXO3a/FOXO3a比值均下降,證明GSK-3β和FOXO3a蛋白激活程度提高。同時FOXO3a/GAPDH的比值升高,證明FOXO3a表達上調(diào)。已有文獻報道證實FOXO3a能夠與IGF-1R蛋白基因的啟動子結(jié)合,促進IGF-1R基因的轉(zhuǎn)錄,最終引起IGF-1R表達的上調(diào)。結(jié)論:肝硬化時血清IGF-1降低,其原因在于肝硬化病理改變引起肝實質(zhì)發(fā)生萎縮,引起肝臟合成功能降低。血清IGF-1降低使得IGF-1R下游通路蛋白IRS-1和AKT的激活程度減低,使AKT對GSK-3β和FOXO3a蛋白的抑制作用有所緩解,GSK-3β和FOXO3a蛋白得以激活。GSK-3β能夠促進FOXO3a蛋白的表達,而FOXO3a能夠和IGF-1R基因的啟動子結(jié)合,從而促進IGF-1R基因的轉(zhuǎn)錄,最終引起肝組織IGF-1R表達的上調(diào)。
【關(guān)鍵詞】：肝硬化 肝臟 IGF-1 IGF-1R AKT GSK-3β FOXO3a
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 提要4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-14
• 英文縮略詞表14-16
• 前言16-18
• 第1章 文獻綜述18-34
• 1.1 IGF系統(tǒng)與肝硬化及肝癌18-26
• 1.1.1 IGF系統(tǒng)簡介18-21
• 1.1.2 IGF系統(tǒng)與肝硬化21-24
• 1.1.3 IGF系統(tǒng)與肝細胞肝癌24-26
• 1.2 GSK-3 的研究進展26-30
• 1.2.1 GSK-3 簡介26-27
• 1.2.2 GSK-3 相關(guān)信號通路27
• 1.2.3 GSK-3 與疾病27-30
• 1.3 FOXO3a的研究進展30-34
• 1.3.1 FOXO蛋白家族簡介30-31
• 1.3.2 FOXO3a的研究進展及臨床意義31-34
• 第2章 材料與方法34-50
• 2.1 實驗材料34-37
• 2.1.1 血清標本34
• 2.1.2 實驗動物34
• 2.1.3 實驗試劑及試劑盒34-35
• 2.1.4 主要抗體35-36
• 2.1.5 實驗儀器36-37
• 2.2 實驗方法37-50
• 2.2.1 主要溶液配制37-40
• 2.2.2 小鼠的飼養(yǎng)40
• 2.2.3 實驗小鼠的分組40-41
• 2.2.4 小鼠肝纖維化模型的建立41-42
• 2.2.5 小鼠挖眼取血法及組織標本的采集及保存42
• 2.2.6 小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活力的測定42-43
• 2.2.7 小鼠肝組織IGF-1R的免疫組織化學(xué)染色43-44
• 2.2.8 小鼠肝組織H&E染色44-45
• 2.2.9 小鼠肝組織Masson染色 （Masson染色試劑盒法）45
• 2.2.10 血清IGF-1 的ELISA測定 （試劑盒法）45-46
• 2.2.11 肝組織總蛋白的提取46-47
• 2.2.12 提取樣品中蛋白質(zhì)的定量（BCA法）47-48
• 2.2.13 蛋白上樣液的制備48
• 2.2.14 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗（Western-blot）48-49
• 2.2.15 統(tǒng)計學(xué)分析49-50
• 第3章 實驗結(jié)果及討論50-74
• 實驗一：肝硬化時血清IGF-1 的變化及引起變化的可能原因50-64
• 3.1.1 實驗結(jié)果50-59
• 3.1.2 討論59-63
• 3.1.3 結(jié)論63
• 3.1.4 創(chuàng)新點63-64
• 實驗二： 肝硬化時肝組織IGF-1R表達水平的變化及其相關(guān)調(diào)控機制64-74
• 3.2.1 實驗結(jié)果64-70
• 3.2.2 討論70-73
• 3.2.3 結(jié)論73
• 3.2.4 創(chuàng)新點73-74
• 參考文獻74-87
• 作者簡介及其在學(xué)期間所取得的科研成果87-88
• 致謝88

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本文編號：641960