發(fā)布時(shí)間：2017-07-26 05:32

  本文關(guān)鍵詞：仿肝板結(jié)構(gòu)肝組織三維培養(yǎng)技術(shù)的研究

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【摘要】：研究背景：肝衰竭是臨床常見的嚴(yán)重肝病癥候群,病死率高達(dá)60%以上,雖然肝移植是目前治療肝衰竭的理想方法,但供體肝來源的嚴(yán)重缺乏和移植排斥等問題限制了其廣泛開展臨床應(yīng)用。生物人工肝是目前肝衰竭患者最有希望獲得較好療效的體外治療手段之一,它不僅為肝衰竭患者等待肝移植提供了過渡時(shí)間,并且還為可逆性肝衰竭患者恢復(fù)其肝功能,從而為避免肝移植提供了可能。目前生物人工肝研究的關(guān)鍵問題之一就是如何利用生物反應(yīng)器在肝細(xì)胞體外培養(yǎng)中長(zhǎng)時(shí)間維持肝細(xì)胞表型和分化功能。體外培養(yǎng)細(xì)胞功能改善的一個(gè)重要原則就是模擬體內(nèi)細(xì)胞環(huán)境,由此,眾多研究學(xué)者提出體外肝細(xì)胞三維培養(yǎng)是解決上述問題的有效途徑。目前,國(guó)內(nèi)外基于生物人工肝生物反應(yīng)器肝細(xì)胞三維培養(yǎng)及其他能為之提供思路的體外肝細(xì)胞三維培養(yǎng)及肝組織構(gòu)建的研究非常多,如中空纖維三維培養(yǎng)、微載體三維培養(yǎng)、球形聚集三維培養(yǎng)、Cell sheets三維培養(yǎng)、快速成型三維培養(yǎng)等,但相關(guān)研究存在共性缺陷：即都只是讓肝細(xì)胞實(shí)現(xiàn)了在三維生長(zhǎng)環(huán)境下生長(zhǎng)培養(yǎng),在肝細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)、肝細(xì)胞形成微結(jié)構(gòu)的有序仿生排列、細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間相互作用等肝細(xì)胞極性建立機(jī)制上都都存在諸多問題沒有解決,而且肝細(xì)胞功能活力也無法與肝細(xì)胞在體相比較。由于肝臟本身就是一個(gè)極佳的肝細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器,生長(zhǎng)于肝臟中的肝細(xì)胞不僅達(dá)到了數(shù)量和密度上的要求,而且呈有序極性肝板排列。研究表明,肝細(xì)胞極性是肝臟獨(dú)特生理功能的基礎(chǔ)。鑒于上述肝細(xì)胞極性與功能的密切關(guān)系,仿生肝臟結(jié)構(gòu)的三維培養(yǎng)模式有望成為解決上述問題的有效途徑。而且體外肝細(xì)胞三維培養(yǎng)設(shè)計(jì)只有最大程度地接近正常肝臟內(nèi)肝細(xì)胞微環(huán)境及結(jié)構(gòu),能夠仿生“肝小葉”、“肝板”,同時(shí),將這一理念與生物人工肝生物反應(yīng)器結(jié)合,實(shí)現(xiàn)生物反應(yīng)器的仿生組織工程化設(shè)計(jì),才能最大程度維持肝細(xì)胞活力功能、分化表型。研究目的：本實(shí)驗(yàn)研究正是基于微流控芯片三維培養(yǎng)技術(shù),通過借鑒肝細(xì)胞在肝臟的極性肝板排列,以及其與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的仿生學(xué)原理,提出仿肝板結(jié)構(gòu)肝組織三維培養(yǎng)技術(shù)研究課題,認(rèn)為仿肝板結(jié)構(gòu)三維培養(yǎng)有助于重建和維持肝細(xì)胞極性從而使肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)中具備更接近于體內(nèi)細(xì)胞的表型和分化功能。本項(xiàng)目擬利用微流控芯片技術(shù)在體外構(gòu)建仿肝板結(jié)構(gòu)肝組織,通過對(duì)這種培養(yǎng)模式下肝細(xì)胞功能進(jìn)行測(cè)定并與其他體外培養(yǎng)模式相比較,以期得到新的適于生物人工肝應(yīng)用的體外肝細(xì)胞培養(yǎng)模式以及新型生物反應(yīng)器,為生物人工肝、肝組織工程、細(xì)胞移植治療、肝臟病理生理等進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法：1、設(shè)計(jì)、制作微流控芯片：經(jīng)過前期大量文獻(xiàn)調(diào)研、反復(fù)設(shè)計(jì)、驗(yàn)證,確定芯片的制作工藝為傳統(tǒng)軟光刻和再鑄模技術(shù),制作材料為聚二甲硅氧烷(PDMS),以及芯片設(shè)計(jì)數(shù)據(jù),后期通過我們的合作方(中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所)對(duì)芯片進(jìn)行加工制作,最終完成芯片的制作。2、實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞、藻酸鹽水凝膠及膠原制備所需溶液準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組設(shè)計(jì)：①實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞準(zhǔn)備：a.人肝細(xì)胞系：(1)C3A (2)HepGL (3)CL-1(LO2)b.人內(nèi)皮細(xì)胞系：EA.hy926c.細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM+10%FBS+1%雙抗②藻酸鹽水凝膠制備所需溶液準(zhǔn)備(詳見正文部分)：③實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)組：仿肝板結(jié)構(gòu)有序三維共培養(yǎng)(其中C3A:EA.hy926=3:1)對(duì)照組1：混合式三維共培養(yǎng)(其中C3A:EA.hy926=3:1)對(duì)照組2：混合式二維共培養(yǎng)(其中C3A:EA. hy926=3:1)每組設(shè)立4個(gè)復(fù)孔。3、仿肝板結(jié)構(gòu)有序三維共培養(yǎng)、混合式三維共培養(yǎng)、混合式二維共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)具體操作(以C3A為例)：①實(shí)驗(yàn)組(仿肝板結(jié)構(gòu)有序三維共培養(yǎng))操作：將海藻酸鈉C3A及EA. hy926細(xì)胞溶液、緩沖液及膠凝液在微量注射泵的作用下持續(xù)通入微流控芯片內(nèi)。海藻酸鈉C3A細(xì)胞懸液、海藻酸鈉EA. hy926細(xì)胞懸液、緩沖液、膠凝液流速為20ul/min、 10ul/min、15ul/min、4ml/h(約66.7ul/min)。由于這四種液體流達(dá)到層流條件,當(dāng)這幾種液體在主反應(yīng)通道交匯后,便開始形成包裹肝板結(jié)構(gòu)的水凝膠。形成水凝膠后,將其導(dǎo)入裝有培養(yǎng)基的TissueFlex(?) Microbioreactors內(nèi)進(jìn)行三維動(dòng)態(tài)灌注培養(yǎng)。其中,為摸索最佳流速條件,細(xì)胞是否形成肝板樣排列,我們采用不同顏色染料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析,找出四種溶液通入微流控芯片的最佳方案及流速,然后再進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,采取活細(xì)胞雙熒光標(biāo)記,激光共聚焦顯微鏡下即時(shí)觀察C3A和EA. hy926的肝板樣位置排布；②對(duì)照組1(混合式三維共培養(yǎng))操作：將C3A和EA. hy926混合后通入芯片,其余步驟同實(shí)驗(yàn)組(仿肝板有序三維共培養(yǎng))；③對(duì)照組2(混合式二維共培養(yǎng))操作：只需將兩種細(xì)胞混合后接種到TissueFlex(?) Microbioreactors中培養(yǎng)即可；待水凝膠內(nèi)形成穩(wěn)定的肝板結(jié)構(gòu)時(shí),將水凝膠浸泡在藻酸鹽裂解酶液中,即可獲取仿肝板肝組織。4、對(duì)以上實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行肝細(xì)胞活力、形態(tài)組織學(xué)、功能、基因表達(dá)水平等進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)：①形態(tài)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)觀察：倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察；觀察時(shí)間分別為第0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13天。②組織學(xué)形態(tài)觀察：雙免疫熒光；分別選取第5、7、10、13天來對(duì)仿肝板結(jié)構(gòu)肝組織以及混合式三維培養(yǎng)下形成的肝組織形態(tài)進(jìn)行觀察與鑒定。③活力動(dòng)態(tài)檢測(cè)：CCK-8；檢測(cè)時(shí)間分別為第0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13天。④功能動(dòng)態(tài)檢測(cè)(蛋白質(zhì)檢測(cè))：膽紅素、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、α1-抗胰蛋白酶、載脂蛋白A1、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、氨甲酰磷酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、尿素、氨、CYP3A4、 CYP1A2、CYP2D6、安定、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、凝血因子Ⅱ、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、孕激素X受體、睪酮；檢測(cè)時(shí)間分別為第0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13天。⑤基因表達(dá)水平動(dòng)態(tài)檢測(cè)(RT-PCR):葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、α1-抗胰蛋白酶、載脂蛋白A1、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、氨甲酰磷酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、CYP3A4、CYP1A2、CYP2D6、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、凝血因子Ⅱ、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、孕激素X受體、肌動(dòng)蛋白β(內(nèi)參)；檢測(cè)時(shí)間分別為第0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13天。5、收集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、得出結(jié)論：所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,每組至少重復(fù)三次。組間差異通過one-way ANOVA檢驗(yàn),然后再做Turkey或Games-Howell post-hoc檢驗(yàn),所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行。當(dāng)P值0.05時(shí),數(shù)據(jù)分析才有顯著性差異,即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、設(shè)計(jì)、制作微流控芯片：經(jīng)過大量文獻(xiàn)調(diào)研、反復(fù)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,我們所設(shè)計(jì)的微流控芯片可用于仿肝板結(jié)構(gòu)肝組織三維構(gòu)建,芯片設(shè)計(jì)合理可行。2、仿肝板結(jié)構(gòu)肝組織三維培養(yǎng)方法步驟：將培養(yǎng)好的3瓶182cm2培養(yǎng)瓶C3A細(xì)胞和2瓶182cm2及2瓶75cm2培養(yǎng)瓶EA. hy926細(xì)胞消化處理,分別可獲取6×107和4× 107細(xì)胞,然后將細(xì)胞混懸于海藻酸鈉溶液中,制備單細(xì)胞懸液。將海藻酸鈉C3A及EA.hy926細(xì)胞溶液、緩沖液及膠凝液通入微流控芯片內(nèi)。其中,先通入緩沖液,再通入海藻酸鈉C3A細(xì)胞溶液、海藻酸鈉EA.hy926細(xì)胞溶液,最后通入膠凝液。這四中液體通入芯片內(nèi)的速度分別為：海藻酸鈉C3A細(xì)胞溶液為20ul/min,海藻酸鈉EA. hy926細(xì)胞溶液為10 ul/min,緩沖液為15 ul/min,膠凝液為4ml/h(約66.7ul/min)。由于通入芯片內(nèi)的液體流可達(dá)到層流狀態(tài),即肝細(xì)胞溶液在芯片主反應(yīng)通道(成膠區(qū))的中間流動(dòng),內(nèi)皮細(xì)胞溶液在肝細(xì)胞溶液兩邊分布,然后內(nèi)皮細(xì)胞溶液外圍是緩沖液,最外邊的液體為膠凝液,肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)肝板結(jié)構(gòu)樣排布,所以最終形成了包裹肝板結(jié)構(gòu)的水凝膠,水凝膠束平均直徑約為100um左右。3、不同顏色染料流體分析、及活細(xì)胞雙熒光標(biāo)記驗(yàn)證形成肝板樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞排布：通過應(yīng)用不同顏色染料進(jìn)行流體分析,得出上述四種液體的流速條件滿足層流條件；進(jìn)一步活細(xì)胞雙熒光標(biāo)記結(jié)果顯示,我們制備出了包裹肝板結(jié)構(gòu)的水凝膠束,水凝膠束內(nèi)包裹著C3A細(xì)胞和EA. hy926細(xì)胞,其中C3A細(xì)胞在中間,約有2到3排,EA. hy926細(xì)胞位于C3A細(xì)胞兩側(cè),呈現(xiàn)肝板結(jié)構(gòu)排布。4、對(duì)以上實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)觀察：仿肝板結(jié)構(gòu)三維共培養(yǎng)組中,肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng),并呈有序肝板結(jié)構(gòu)排列生長(zhǎng),培養(yǎng)初期,肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)出增值的趨勢(shì),隨著細(xì)胞增值到一定數(shù)量,由于水凝膠的外包被束縛,肝細(xì)胞會(huì)逐漸與內(nèi)皮細(xì)胞融合成一體,形成一個(gè)微型肝組織條索,細(xì)胞增殖幾乎停滯,處于維持階段,細(xì)胞存活良好。混合式三維共培養(yǎng)組中,肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng),但呈無序混合排列生長(zhǎng),培養(yǎng)初期,肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)出增值的趨勢(shì),隨著細(xì)胞增值到一定數(shù)量,由于水凝膠的外包被束縛,肝細(xì)胞會(huì)逐漸與內(nèi)皮細(xì)胞融合成一體,形成一個(gè)微型肝組織條索,細(xì)胞增殖幾乎停滯,處于維持階段,細(xì)胞存活良好,但細(xì)胞形態(tài)較仿肝板結(jié)構(gòu)三維共培養(yǎng)組略差�；旌鲜蕉S共培養(yǎng)組中,肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng),但呈無序混合排列生長(zhǎng),培養(yǎng)初期,肝細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)出增值的趨勢(shì),隨著細(xì)胞增值到一定數(shù)量,細(xì)胞長(zhǎng)滿,生長(zhǎng)空間受限,細(xì)胞接觸抑制,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)變差,趨向凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：運(yùn)用我們所設(shè)計(jì)制作的微流控芯片、在反復(fù)摸索微流控條件及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證下,成功構(gòu)建了仿肝板結(jié)構(gòu)肝組織,并建立了相關(guān)技術(shù)體系,為體外肝細(xì)胞三維培養(yǎng)提供了一種新的培養(yǎng)模式,有望使肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)中具備更接近于體內(nèi)細(xì)胞的表型和分化功能,同時(shí)也為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。而且該研究采用的均為人源性細(xì)胞,所形成的研究成果將能更好地應(yīng)用于生物人工肝、細(xì)胞移植治療、藥物檢測(cè)與評(píng)價(jià)等臨床應(yīng)用研究之中。
【關(guān)鍵詞】：生物人工肝 生物反應(yīng)器 仿生學(xué) 三維培養(yǎng) 肝細(xì)胞極性
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575.3
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-23
• 材料與方法23-43
• 一、材料23-27
• 二、方法27-42
• 三、統(tǒng)計(jì)方法42-43
• 結(jié)果43-54
• 一、設(shè)計(jì)、制作微流控芯片43-44
• 二、實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞、藻酸鹽水凝膠所需溶液準(zhǔn)備44
• 三、仿肝板結(jié)構(gòu)有序三維共培養(yǎng)、混合式三維共培養(yǎng)、混合式二維共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)具體操作步驟44-49
• 四、對(duì)以上實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)觀察49-54
• 討論54-58
• 全文總結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-66
• 附錄：縮略語和中英文對(duì)照表66-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果67-68
• 致謝68-71

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 周鵬程;微囊懸浮型流化床式生物人工肝治療急性肝衰竭豬的血清代謝組學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：574942