本文關(guān)鍵詞：毛囊源性iPS細(xì)胞經(jīng)定行內(nèi)胚層誘導(dǎo)為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的研究

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【摘要】：背景眾所周知,i PS細(xì)胞具有與ES細(xì)胞相似的形態(tài)、基因表型及多向分化、自我更新能力,并且回避了ES細(xì)胞所面臨的倫理學(xué)的困擾。目前已有文獻(xiàn)報道有關(guān)i PS細(xì)胞肝向誘導(dǎo)的成功案例,但是仍有許多問題亟待解決。首先,靶細(xì)胞的選擇是至關(guān)重要的。國內(nèi)、外實驗室使用的i PS細(xì)胞的重編程靶細(xì)胞為:皮膚成纖維細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、臍帶血來源CD34+細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞等,其中最常見的是皮膚成纖維細(xì)胞。本實驗室創(chuàng)新性地重編程毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞為i PS細(xì)胞,建立了毛囊源性i PS細(xì)胞系,具有取材廣泛、安全、簡便、無創(chuàng)等優(yōu)點。其次,傳統(tǒng)的誘導(dǎo)方法是通過擬胚體(EB)階段進(jìn)行i PS細(xì)胞的肝向誘導(dǎo)。擬胚體途徑的主要目的是模擬體內(nèi)的胚胎發(fā)育過程,擬胚體中的三胚層細(xì)胞可以互相支持、互相提供細(xì)胞生長分化所必需的微環(huán)境。但是,由于擬胚體的特殊三維立體結(jié)構(gòu),其分化后的細(xì)胞處于不同的分化階段,限制了所得成體細(xì)胞臨床應(yīng)用的可能性;擬胚體不僅可以分化為肝細(xì)胞,亦可分化為胰腺細(xì)胞,降低了細(xì)胞的純度;經(jīng)由擬胚體得到的細(xì)胞壽命較短。因此,我們必須探索出一個新的誘導(dǎo)途徑,以達(dá)到i PS細(xì)胞高效肝向誘導(dǎo)的目的。本實驗繞過擬胚體階段,經(jīng)由定行內(nèi)胚層階段,模擬體內(nèi)肝細(xì)胞的生長發(fā)育模式,促使i PS細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞方向分化。本方案顯著提高了i PS細(xì)胞體外肝向誘導(dǎo)的效率、細(xì)胞的壽命及細(xì)胞的數(shù)量。最后,目前已有的誘導(dǎo)方法仍存在效率較低這個致命的問題,因此我們在誘導(dǎo)方法上進(jìn)行了優(yōu)化改良。我們將HGF應(yīng)用于i PS細(xì)胞的肝向誘導(dǎo)中,在誘導(dǎo)的早期,加入了大劑量的HGF,從而有效地促進(jìn)了定行內(nèi)胚層形成,遵循了高效性的原則。方法本實驗選擇毛囊源性i PS細(xì)胞為實驗對象,對其進(jìn)行體外誘導(dǎo),繞過擬胚體階段,經(jīng)過定行內(nèi)胚層向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化,并對所得細(xì)胞進(jìn)行鑒定。本實驗具有以下幾個優(yōu)點:(1)本實驗室重編程毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞,構(gòu)建了新的毛囊源性i PS細(xì)胞系,細(xì)胞的來源更加豐富,且取材更加安全、無創(chuàng)、簡便;(2)與傳統(tǒng)誘導(dǎo)方法相比,我們繞過了擬胚體階段,經(jīng)定行內(nèi)胚層進(jìn)行i PS細(xì)胞的肝向誘導(dǎo),提高了細(xì)胞的純度與壽命,確保實驗的有效性、高效性;(3)我們在誘導(dǎo)的初期使用了大劑量的HGF,從而促進(jìn)了i PS細(xì)胞向定行胚層(DE)的誘導(dǎo)分化,增加了DE形成的比例。結(jié)果本實驗選用毛囊源性i PS細(xì)胞為對象,相差顯微鏡觀察其細(xì)胞呈克隆樣排列;RT-PCR證實其不表達(dá)DE、HLCs的特異性標(biāo)記基因。經(jīng)過4天誘導(dǎo)后的定行內(nèi)胚層細(xì)胞,相差顯微鏡觀察其細(xì)胞連接斷裂,細(xì)胞體積變大;RT-PCR證實有DE的特異性標(biāo)記基因SOX17、FOXa2的表達(dá);免疫熒光染色提示其在蛋白水平上有SOX17的表達(dá)。我們得到的HLCs經(jīng)相差顯微鏡觀察可知其細(xì)胞體積較大,呈多角形,細(xì)胞核呈圓形;RT-PCR證實具有肝細(xì)胞特異性標(biāo)記基因ALB,AFP,HNF4α,AAT,CYP3A4和CK18的表達(dá);免疫熒光染色表明其在蛋白水平上表達(dá)ALB,AFP,CYP3A4和CYP7A1;功能鑒定提示HLCs具有糖原貯存、LDL攝取和ICG攝入和排泄功能。結(jié)論本實驗選擇毛囊源性i PS細(xì)胞為靶細(xì)胞,取材安全無創(chuàng)。在誘導(dǎo)方法上,我們首先選擇了經(jīng)定行內(nèi)胚層進(jìn)行誘導(dǎo),避免了擬胚體階段,從而提高了細(xì)胞壽命和誘導(dǎo)效率,其次,我們在誘導(dǎo)的初期加入大劑量的HGF,大大促進(jìn)了定行內(nèi)胚層的形成,從而保證i PS細(xì)胞能夠迅速、有效的向肝細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化。通過我們的方法,可以大量地生產(chǎn)i PS源性肝細(xì)胞樣細(xì)胞,為廣大的肝衰病人帶來福音和生命的希望。
【關(guān)鍵詞】：干細(xì)胞 iPS細(xì)胞 定行內(nèi)胚層 肝細(xì)胞樣細(xì)胞 細(xì)胞治療
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 英文縮略詞表8-13
• 第1章 引言13-24
• 1.1 iPS細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)13-15
• 1.2 iPS細(xì)胞的分化潛能15-16
• 1.3 肝臟疾病細(xì)胞治療的現(xiàn)狀16-18
• 1.4 iPS細(xì)胞在肝臟疾病中的應(yīng)用潛能18-19
• 1.5 iPS細(xì)胞向肝細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)方案19-22
• 1.5.1 iPS細(xì)胞向定行內(nèi)胚層細(xì)胞分化20-21
• 1.5.2 iPS細(xì)胞肝向分化21
• 1.5.3 iPS源性肝細(xì)胞功能的成熟21-22
• 1.5.4 iPS源性肝細(xì)胞樣細(xì)胞的特征及功能評估22
• 1.6 研究前景與面臨問題22-24
• 第2章 材料與方法24-35
• 2.1 材料24-26
• 2.1.1 主要儀器和設(shè)備24-25
• 2.1.2 主要試劑25-26
• 2.2 實驗方法26-35
• 2.2.1 iPS細(xì)胞的復(fù)蘇26-27
• 2.2.2 挑取克隆27
• 2.2.3 鋪制飼養(yǎng)層27-28
• 2.2.4 iPS細(xì)胞的傳代28-29
• 2.2.5 iPS細(xì)胞的凍存29
• 2.2.6 iPS細(xì)胞體外誘導(dǎo)29-31
• 2.2.7 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）31-32
• 2.2.8 免疫熒光染色32-33
• 2.2.9 糖原染色（PAS染色）33
• 2.2.10 LDL攝取實驗33-34
• 2.2.11 ICG攝取與排泄實驗34-35
• 第3章 實驗結(jié)果35-46
• 3.1 毛囊源性iPS細(xì)胞經(jīng)定行內(nèi)胚層向肝細(xì)胞樣細(xì)胞的誘導(dǎo)35
• 3.2 定行內(nèi)胚層的形成35-36
• 3.3 定行內(nèi)胚層特異基因表達(dá)36-37
• 3.4 定行內(nèi)胚層蛋白水平表達(dá)情況37-39
• 3.5 定行內(nèi)胚層向肝細(xì)胞樣細(xì)胞(HLCS)的誘導(dǎo)39
• 3.6 肝細(xì)胞樣細(xì)胞(HLCS)的特異性基因39-40
• 3.7 HLCS的蛋白水平表達(dá)情況40-43
• 3.8 HLCS的功能學(xué)鑒定43-46
• 3.8.1 HLCs的糖原合成與貯存功能43-44
• 3.8.2 HLCs的LDL攝取能力44-45
• 3.8.3 HLCs的ICG攝取與排泄能力45-46
• 第4章 討論46-49
• 4.1 體外誘導(dǎo)靶細(xì)胞的選擇46-47
• 4.2 定行內(nèi)胚層的優(yōu)勢47
• 4.3 誘導(dǎo)方法的優(yōu)化與改良47-49
• 第5章 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 作者簡介及在學(xué)期間所取得的科研成果56-57
• 致謝57

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本文編號：534494