調(diào)控基因的表達和后續(xù)生成對人類病原體的持續(xù)和慢性感染至關重要,如乙型肝炎病毒（HBV）,感染全球范圍超過4億人,是導致肝臟疾病的重要原因。在這項研究中,我們首次提供了一個肝臟特異的微小RNA, miR-122,通過堿基配對相互作用方式與一個高度保守的HBV前基因組RNA序列結合,抑制HBV基因表達和復制的直接證據(jù)。miR-122的靶序列同時也位于病毒聚合酶mRNA的編碼區(qū)和核心蛋白mRNA的3,非編碼區(qū)。培養(yǎng)的細胞中,miR-122表達量的增加導致HBV基因表達和復制的減少,而在HBV復制和感染存在的情況下,miR-122的表達減少。此外,對臨床標本的分析表明在HBV陽性患者外周血單核細胞中,miR-122水平和病毒載量之間在體內(nèi)呈負線性關系。我們的研究結果表明miR-122可通過和病毒靶序列的結合,下調(diào)HBV的復制,利于了解HBV持續(xù)/慢性感染,并且HBV導致的對miR-122表達的調(diào)控可能代表了促進病毒發(fā)病機理的機制。一旦病毒的成分被模式識別受體識別,包括Toll樣受體（TLRs）和維甲酸誘導基因Ⅰ（RIG-I）樣解旋酶,細胞被激活,產(chǎn)生I型干擾素（IFN）和炎性細胞因子。這些途徑... 

【文章來源】：武漢大學湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
引言
第一部分 綜述
    第一章 乙型肝炎病毒
        1.1 HBV的歷史背景及其感染的流行病學簡介
        1.2 HBV的病毒特征
        1.3 HBV的轉(zhuǎn)錄和復制
            1.3.1 HBV的轉(zhuǎn)錄
            1.3.2 HBV的復制
        1.4 HBV的免疫發(fā)病機理
        1.5 人類宿主中的HBV周期
        1.6 HBV的預防和治療
            1.6.1 HBV的預防
            1.6.2 HBV的治療
    第二章 丙型肝炎病毒
        2.1 HCV的結構和基因組
            2.1.1 HCV的結構
            2.1.2 HCV的基因組結構
        2.2 HCV的復制和生命周期
        2.3 HCV細胞內(nèi)逃避免疫機制
            2.3.1 宿主對感染的反應
            2.3.2 HCV引起的宿主反應
            2.3.3 HCV調(diào)控和逃避宿主反應
            2.3.4 HCV調(diào)控干擾素通路
            2.3.5 HCV調(diào)控ISG的表達或功能
            2.3.6 病毒遺傳變異和感染后的宿主反應
            2.3.7 miRNA及HCV感染
            2.3.8 HCV-宿主相互作用模型
    第三章 治療肝癌的新方法：小分子RNA(miRNA)療法
        3.1 miRNA和它們在病毒感染中的作用
        3.2 DNA病毒編碼的miRNA
            3.2.1 皰疹病毒編碼的miRNA
            3.2.2 埃博拉病毒編碼的miRNA(EBV)
        3.3 miRNAs編碼的其它DNA病毒
            3.3.1 猴腎病毒40(SV40)和其他多瘤病毒
            3.3.2 腺病毒編碼的miRNA
        3.4 RNA病毒編碼的miRNAs
        3.5 宿主miRNA及其同病毒感染的相互作用
            3.5.1 在病毒感染中起止面調(diào)節(jié)作用的miRNA
            3.5.2 在病毒感染中起負面調(diào)節(jié)作用的miRNA
        3.6 miRNA的肝臟生物學
            3.6.1 肝癌中的miRNA表達譜
            3.6.2 miRNA和病毒性肝炎
            3.6.3 肝特異性miRNA：miR-122在肝病中的特征
            3.6.4 肝癌中高表達miRNA：miR-21的特征
            3.6.5 miRNA可做為通用的抗癌治療因子
第二部分 肝特異性miRNA和HBV的相互作用研究
    第四章 前言
    第五章 在人肝細胞中HBV下調(diào)miR-122的表達
        5.1 引言
        5.2 實驗材料及儀器
            5.2.1 細胞
            5.2.2 實時定量(Real-Time)PCR檢測引物
            5.2.3 工具酶
            5.2.4 其他生物試劑
            5.2.5 化學試劑和儀器
        5.3 實驗方法
            5.3.1 哺乳動物細胞培養(yǎng)
            5.3.2 細胞系總RNA提取及Real-Time PCR反應
        5.4 實驗結果及討論
            5.4.1 HepG2.2.15細胞中miR-122表達水平明顯低于HepG2細胞
            5.4.2 HepG2.2.15細胞和HepG2細胞miRNA芯片分析結果
    第六章 miR-122抑制HBV基因的表達和復制
        6.1 引言
        6.2 實驗材料及儀器
            6.2.1 細菌菌種和質(zhì)粒
            6.2.2 合成寡核苷酸
            6.2.3 哺乳動物細胞株/系
            6.2.4 細菌/細胞培養(yǎng)基
            6.2.5 化學試劑和實驗儀器
            6.2.6 試劑盒和轉(zhuǎn)染試劑
        6.3 實驗方法
            6.3.1 哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染用高純度質(zhì)量的提取(Tiangen試劑盒為例)
            6.3.2 哺乳動物細胞的培養(yǎng)、復蘇和凍存(見第五章)
            6.3.3 哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染
            6.3.4 乙肝表面抗原(s),e抗原的檢測
            6.3.5 Northern Blot檢測HBV RNA水平
            6.3.6 HBV復制中間體(HBV capsid-associated viral DNA)熒光定量PCR檢測
        6.4 實驗結果及討論
            6.4.1 通過轉(zhuǎn)染合成寡核苷酸可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)miR-122的表達水平
            6.4.2 miR-122抑制HBV蛋白的表達
            6.4.3 miR-122可抑制HBV RNA的表達及DNA的復制
    第七章 HBV聚合酶為miR-122的靶mRNA編碼基因
        7.1 引言
        7.2 實驗材料及儀器
            7.2.1 細菌菌種和質(zhì)粒
            7.2.2 哺乳動物細胞株/系
            7.2.3 構建所用引物：如表6.1所示
            7.2.4 工具酶、試劑盒及抗體
            7.2.5 其他生物試劑
            7.2.6 化學試劑和儀器
        7.3 實驗方法
            7.3.1 哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染用高純質(zhì)粒提取(見第六章)
            7.3.2 哺乳動物的培養(yǎng)、復蘇和凍存(見第六章)
            7.3.3 哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染(見第六章)
            7.3.4 熒光素酶報告基因檢測
            7.3.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)
        7.4 實驗結果及討論
            7.4.1 HBV聚合酶基因為miR-122的靶mRNA編碼基因
            7.4.2 miR-122也通過類似的機制調(diào)控adw亞型的HBV基因表達和復制
    第八章 miR-122通過與HBV的靶RNA序列堿基配對的相互作用調(diào)控HBV感染
        8.1 引言
        8.2 實驗材料及儀器
            8.2.1 細菌菌種和質(zhì)粒
            8.2.2 哺乳動物細胞株/系
            8.2.3 構建所需引物及合成寡合甘酸：如表8.1所示
            8.2.4 試劑及儀器
        8.3 實驗方法
            8.3.1 哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染用高純質(zhì)粒提取(見第六章)
            8.3.2 哺乳動物的培養(yǎng)、復蘇和凍存(見第六章)
            8.3.3 哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染(見第六章)
            8.3.4 乙肝表面抗原(s),e抗原的檢測(見第六章)
            8.3.5 HBV復制中間體(HBV capsid-associated viral DNA)熒光定量PCR檢測(見第六章)
            8.3.6 一步法突變構建HBV1.3倍體上miR-122靶標序列的相應特異性位點突變體
            8.3.7 Northern Blot檢測HBV與miR-122的雜交
        8.4 實驗結果和討論
    第九章 體內(nèi)HBV感染和miR-122表達水平的相關性研究
        9.1 引言
        9.2 實驗材料及儀器
            9.2.1 臨床標本
            9.2.2 試劑和儀器
        9.3 實驗方法
            9.3.1 miRNA檢測(見第五章)
            9.3.2 血樣中外周血單核細胞(PBMC)的分離
            9.3.3 血樣中HBV病毒載量的熒光定量PCR檢測
        9.4 實驗結果和討論
    第十章 總論
第三部分 在癌癥中普遍上調(diào)的miRNA和HCV的相互作用研究
    第十一章 前言
    第十二章 HCV的感染上調(diào)miR-21的表達
        12.1 引言
        12.2 實驗材料及儀器
            12.2.1 細菌菌種,質(zhì)粒和病毒
            12.2.2 哺乳動物細胞株/系
            12.2.3 試劑及儀器
        12.3 實驗方法
            12.3.1 哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染用高純質(zhì)粒提取(見第六章)
            12.3.2 哺乳動物細胞的培養(yǎng)、復蘇和凍存(見第六章)
            12.3.3 哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染(見第六章)
            12.3.4 miRNA檢測(見第五章)
            12.3.5 外周血淋巴細胞(PBMC)的分離和培養(yǎng)
            12.3.6 HCV的感染和保存
            12.3.7 pFL-J6/JFH-1的線性化,體外轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)染
        12.4 實驗結果及討論
    第十三章 miR-21可抑制HCV觸發(fā)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)物的表達
        13.1 引言
        13.2 實驗材料及儀器
            13.2.1 合成寡核苷酸和實驗所需引物
            13.2.2 病毒,試劑盒和抗體
            13.2.3 其它材料和儀器
        13.3 實驗方法
            13.3.1 細胞上清中IFN-α蛋白含量的ELISA檢測
            13.3.2 半定量PCR檢測
            13.3.3 其它實驗方法
        13.4 實驗結果及討論
            13.4.1 在肝細胞內(nèi)miR-21抑制HCV觸發(fā)的Ⅰ型干擾素產(chǎn)物的合成
            13.4.2 miR-21通過拮抗HCV引起的IFN-α抗病毒反應促進HCV的復制
            13.4.3 miR-21的過表達可抑制IFN-α引起的抗病毒反應
    第十四章 MyD88和IRAK1為miR-21的靶標基因
        14.1 引言
        14.2 實驗材料及儀器
            14.2.1 合成寡核苷酸及實驗所需引物
            14.2.2 哺乳動物細胞
            14.2.3 質(zhì)粒
            14.2.4 其它實驗試劑及儀器
        14.3 實驗方法
            14.3.1 3’UTR熒光素酶報告系統(tǒng)的構建
            14.3.2 流式細胞檢測
            14.3.3 其它實驗方法
        14.4 實驗結果及討論
            14.4.1 miR-21調(diào)節(jié)TLR-7信號級聯(lián)通路中各組成成分的基因表達
            14.4.2 MyD88和IRAK1為miR-21的靶標
            14.4.3 miR-21對IFN信號通路的調(diào)控受MyD88和IRAK1介導
    第十五章 總論
參考文獻
攻博期間發(fā)表和待發(fā)表的論文
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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