目的本課題在CRISPR/Cas9技術(shù)的支持下,通過(guò)基因編輯Gp96序列,抑制其基因表達(dá),研究Gp96在急性酒精性肝損傷過(guò)程中的作用及調(diào)控的分子機(jī)制。方法（一）設(shè)計(jì)質(zhì)粒:NCBI中檢索Gp96相關(guān)基因序列,在外顯子中查找人鼠相同的Gp96基因序列,根據(jù)二者的蛋白保守功能域位置,將靶向突變的目標(biāo)序列（CRISPR）設(shè)計(jì)在外顯子4⁹。將外顯子4至外顯子9進(jìn)行序列比對(duì),共發(fā)現(xiàn)6個(gè)相同的CRISPR序列位置,但經(jīng)脫靶率分析后最終設(shè)計(jì)出3個(gè)CRISPR序列,并構(gòu)建三種質(zhì)粒。（二）有效sgRNA篩選及驗(yàn)證:將合成的三種質(zhì)粒1:1:1混合轉(zhuǎn)染小鼠成肌細(xì)胞C2C12,嘌呤酶素篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞,提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳、膠回收進(jìn)行測(cè)序及有效sgRNA蛋白驗(yàn)證。（三）體外實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)小鼠成肌細(xì)胞C2C12,分為三組,Normal組:不做任何處理;Normal+alcohol組:直接給予酒精誘導(dǎo)培養(yǎng);Gp96-sgRNA+alcohol組:將有效sgRNA進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后給予酒精誘導(dǎo)培養(yǎng)。CCK-8細(xì)胞活性增殖檢測(cè);Hoechst33258細(xì)胞凋亡染色;免疫印跡檢測(cè)相關(guān)因子表達(dá):熱... 

【文章來(lái)源】：河南科技大學(xué)河南省

【文章頁(yè)數(shù)】：76 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 酒精性肝損傷概述
        1.1.1 酒精性肝損傷的流行病學(xué)
        1.1.2 酒精性肝損傷的病理學(xué)特點(diǎn)
    1.2 酒精性肝損傷機(jī)制
        1.2.1 酒精及其代謝產(chǎn)物對(duì)肝臟的毒作用
        1.2.2 氧化應(yīng)激與酒精性肝損傷
        1.2.3 細(xì)胞凋亡與酒精性肝損傷
    1.3 急性酒精性肝損傷模型的制備
    1.4 熱休克蛋白Gp96
        1.4.1 熱休克蛋白概述
        1.4.2 Gp96的分子結(jié)構(gòu)
        1.4.3 GP96的功能和應(yīng)用
    1.5 CRISPR/Cas9技術(shù)概述
        1.5.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)
        1.5.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)
        1.5.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用機(jī)制
        1.5.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用現(xiàn)狀
第2章 前言
第3章 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 細(xì)胞
        3.1.2 質(zhì)粒
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.4 主要儀器設(shè)備
        3.1.5 主要實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.6 主要溶液配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
        3.2.2 CRISPR/Cas9技術(shù)靶向突變小鼠Gp96基因三合一質(zhì)粒構(gòu)建
        3.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)
        3.2.4 提取質(zhì)粒
        3.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.6 確定最佳嘌呤酶素濃度
        3.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.2.8 嘌呤酶素篩選
        3.2.9 PCR技術(shù)檢測(cè)
        3.2.10 膠回收DNA
    3.3 體外實(shí)驗(yàn)
        3.3.1 免疫印跡蛋白檢測(cè)
        3.3.2 CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)
        3.3.3 Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況
    3.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
        3.4.1 血清AST、ALT酶活性的檢測(cè)
        3.4.2 肝組織蠟塊包埋及組織切片制作
        3.4.3 HE染色檢測(cè)各組小鼠的肝臟損傷情況
        3.4.4 PAS法檢測(cè)各組小鼠肝臟中糖原的表達(dá)情況
        3.4.5 Hoechst33258染色法檢測(cè)小鼠的肝細(xì)胞凋亡情況
        3.4.6 免疫印跡蛋白檢測(cè)
    3.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
第4章 結(jié)果
    4.1 CRISPR/Cas9技術(shù)靶向突變小鼠GP96基因三合一質(zhì)粒
        4.1.1 設(shè)計(jì)CRISPR序列
        4.1.2 YSY線性化三合一CRISPR/Cas9質(zhì)粒構(gòu)建
        4.1.3 轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證
        4.1.4 轉(zhuǎn)化子的測(cè)序驗(yàn)證
    4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和sgRNA活性驗(yàn)證
        4.2.1 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)
        4.2.2 測(cè)序篩選sgRNA3為有效向?qū)NA
        4.2.3 免疫印記驗(yàn)證有效sgRNA3
    4.3 細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果
    4.4 細(xì)胞Hoechst33258染色結(jié)果
    4.5 免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)結(jié)果
    4.6 小鼠血清ALT、AST酶活性的檢測(cè)結(jié)果
    4.7 肝臟組織HE染色結(jié)果
    4.8 肝臟組織PAS染色結(jié)果
    4.9 肝臟組織Hoechst33258染色結(jié)果
    4.10 免疫印跡法檢測(cè)組織蛋白的表達(dá)結(jié)果
第5章 討論
    5.1 Gp96與酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用
    5.2 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96與轉(zhuǎn)氨酶和組織損傷的關(guān)系
    5.3 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和糖原儲(chǔ)備的關(guān)系
    5.4 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和細(xì)胞凋亡的關(guān)系
    5.5 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96對(duì)肝細(xì)胞應(yīng)激分子HSP27、HSP70的影響
    5.6 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96對(duì)肝細(xì)胞增殖的作用
    5.7 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和VEGF的關(guān)系
    5.8 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和p-STAT3信號(hào)途徑的關(guān)系
    5.9 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和CYP2E1的關(guān)系
    5.10 小鼠急性酒精性肝損傷中Gp96和TNF-α的關(guān)系
    5.11 問(wèn)題與展望
第6章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
縮略語(yǔ)詞匯表
附錄Ⅰ 圖及說(shuō)明
致謝
攻讀學(xué)位期間的研究成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CD133表位聯(lián)合熱休克蛋白佐劑疫苗引發(fā)抗白血病的免疫應(yīng)答（英文）[J]. 王碩,范紅霞,李楊,鄭華國(guó),李鑫,李長(zhǎng)菲,陳立釗,鞠瑩,孟頌東.  生物工程學(xué)報(bào). 2017(06)
[2]CYP2E1調(diào)控酒精性肝病發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 陳丹,林秀賢,陳堯.  中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué). 2017(02)
[3]檉柳對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制[J]. 張鈺,韓琛,王朝霞,王兆朋,張?jiān)掠?周淑萍,馬冉冉,王恒孝.  山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2017(02)
[4]CRISPR-Cas9研究及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 李肅,吳楠,孫冬琳,金焰.  國(guó)際遺傳學(xué)雜志. 2016 (06)
[5]熱休克蛋白gp96 3′UTR作為ceRNA通過(guò)miR-642a調(diào)控DOHH的表達(dá)[J]. 盛春海,孫璐,初驍宇,李長(zhǎng)菲,孟頌東.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2016(10)
[6]腸道菌群與酒精性肝病[J]. 熊燕鵑,羅和生.  胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志. 2016(09)
[7]對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷過(guò)程中IL-6跨信號(hào)途徑對(duì)PCNA表達(dá)的影響[J]. 韓紅梅,李三強(qiáng),盧華杰,張勇勇,王秀秀,馬曌.  胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志. 2016(09)
[8]小鼠酒精性肝損傷過(guò)程中肝糖原的表達(dá)變化[J]. 尚付梅,李三強(qiáng),盧華杰,姜雅坤,喬新杰,白淼水,霍續(xù)磊,李小蘋(píng),李思源,李英嬌.  中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志. 2016(09)
[9]酒精性肝損傷的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展[J]. 王東,張宏峰,王改琴,賈書(shū)花.  長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào). 2016(02)
[10]酒精性肝病流行病學(xué)及發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 高瀟雪,劉立新.  中華消化病與影像雜志(電子版). 2016(02)



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