本文關(guān)鍵詞：Locostatin對肝纖維化小鼠肝臟膠原代謝的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是由各種致病因子如病毒、酒精、化學藥物等引起慢性肝細胞損傷,導致細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)過度沉積,纖維結(jié)締組織異常增生的一個病理過程。肝纖維化是肝炎發(fā)展為肝硬化、肝癌的必經(jīng)階段,因此預防、治療甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化成為慢性肝病研究的重點。肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)與肝纖維化的形成密切相關(guān),當肝臟受到損傷刺激時,靜止狀態(tài)的HSCs轉(zhuǎn)化為激活狀態(tài)的肌成纖維細胞樣細胞(myofibroblast cells, MFCs),引起ECM合成及降解異常,導致肝臟結(jié)構(gòu)和功能的改變。ECM的主要成份是膠原,在肝纖維化中主要以Ⅰ、Ⅲ型膠原明顯增加為主。膠原代謝受到基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)的調(diào)節(jié)。因此HSCs的活化是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。肝纖維化的形成伴隨著Raf-1/MEK/ERK1,2信號通路的激活,該通路的激活可以促進HSCs的增殖、分化和遷移。Raf激酶抑制蛋白(raf kinase inhibitor protein, RKIP)是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白家族(phosphatid-ylethanolalmine binding proteins, PEBPs)中的成員,從植物到哺乳動物都有發(fā)現(xiàn),可以調(diào)節(jié)多種信號通路的轉(zhuǎn)導。RKIP與Raf-1激酶域相互作用,抑制Raf-1/MEK/ERK1,2信號通路的轉(zhuǎn)導。而RKIP的過表達可以促進HSCs的遷移。Locostatin是一種無抗菌活性的黃惡唑酮衍生物,是RKIP特異性抑制劑。本論文應用四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)誘導小鼠肝纖維化形成,并通過腹腔注射Locostatin進行干預,旨在研究Locostatin對小鼠肝纖維化的影響及其作用機制。目的：CCl4誘導小鼠肝臟纖維化過程中,腹腔注射RKIP特異性抑制劑Locostatin進行干預,通過對肝臟炎癥及纖維化指標的檢測,研究Locostatin能否延緩肝纖維化的進展,甚至預防、阻止肝纖維化形成。方法：將27只小鼠隨機分為正常對照組,模型組,治療組。治療組在CCl4誘導小鼠肝纖維化模型過程中,通過腹腔注射Locostatin進行干預。通過檢測血清中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase,AST)的水平及肝臟組織HE染色來研究肝臟炎癥程度的變化,通過血清羥脯氨酸(hydroxyproline, HYP)及肝臟組織Masson、苦味酸-天狼星紅染色研究膠原的變化。通過實時定量聚合酶鏈式反應(reverse transcription quantitative PCR, RT-qRCR)分析I型膠原、III型膠原、IV型膠原、MMP-13、MMP-2、 TIMP-1、TIMP-2、RKIP及α-SMA基因水平的表達。通過免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)及western blot方法分析I型膠原、III型膠原、IV型膠原、α-SMA及RKIP蛋白的表達。運用酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)測定MMP-13、MMP-2、TIMP-1及TIMP-2蛋白的表達量。結(jié)果：1 Locostatin可以抑制炎癥反應,減少HSCs活化及膠原沉積：在HE染色中模型組炎癥重于治療組,正常對照組無炎癥反應。在Masson染色及苦味酸-天狼星紅染色中模型組膠原含量多于治療組,正常對照組未見膠原在異常部位的沉積。IHC中模型組I、III型膠原及α-SMA的表達多于治療組,正常對照組表達最少。IV型膠原在模型組表達量最低,治療組表達量最高。模型組ALT(189.43±64.25)水平明顯高于(P0.01)正常對照組(8.06±4.46)及治療組(61.88±5.40)水平,正常對照組與治療組無顯著性差異(P0.05)。模型組AST(231.15±39.86)水平明顯高于(P0.01)正常對照組(39.46±23.11)及治療組(84.61±29.36)水平,正常對照組與治療組無顯著性差異(P0.05)。模型組HYP(3.07±0.47)水平明顯高于(P0.01)正常對照組(1.63±0.78)及治療組(2.06±0.83)水平,正常對照組與治療組無顯著性差異(P0.05)。2 Locostatin可以降低I型膠原、III型膠原及α-SMA mRNA的表達量,增加IV型膠原及RKIP mRNA的表達量。2.1 Locostatin可以降低I型及III型膠原mRNA的表達量：治療組I型膠原mRNA的相對表達量(3.60±0.31)較模型組(9.51±1.37)顯著降低(P0.01)。治療組III型膠原mRNA的相對表達量(1.25±0.22)較模型組(3.23±0.43)顯著降低(P0.01)。2.2模型組中IV型膠原mRNA表達量減少,Locostatin可以增加IV型膠原mRNA表達量：模型組IV型膠原mRNA的相對表達量(0.71±0.21)較治療組(4.80±1.22)顯著降低(P0.01)。2.3模型組TIMP-1、MMP-13、TIMP-2、MMP-2 mRNA的相對表達量(0.84±0.14,0.91±0.02,0.45±0.05,0.73±0.25)較治療組(0.79±0.13,0.60±0.22,0.49±0.18,0.58±0.16)無明顯差異(P0.05)。2.4 Locostatin可以降低α-SMA mRNA表達量：模型組α-SMA mRNA相對表達量(6.73±0.10)較治療組(2.71±0.31)顯著升高(P0.01)。2.5 Locostatin可以增加RKIP mRNA的表達量：治療組RKIP mRNA的相對表達量(3.49±0.50)較模型組(1.06±0.16)顯著升高(P0.01)。3 Locostatin可以降低Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、α-SMA蛋白表達量,增加Ⅳ型膠原、RKIP蛋白表達量。3.1模型組中Ⅰ型膠原蛋白表達升高,Locostatin可以降低Ⅰ型膠原蛋白表達：治療組(0.68±0.06)較正常對照組(0.22±0.04)Ⅰ型膠原蛋白的表達量顯著增高(P0.01),治療組I型膠原蛋白表達量較模型組(1.37±0.13)明顯降低(P0.01)。3.2模型組中Ⅲ型膠原蛋白表達升高,Locostatin可以降低Ⅲ型膠原蛋白表達：治療組(0.16±0.02)較正常對照組(0.11±0.02)Ⅲ型膠原蛋白的表達量顯著增高(P0.01),治療組Ⅲ型膠原蛋白表達量較模型組(0.26±0.07)明顯降低(P0.01)。3.3模型組中Ⅳ型膠原蛋白表達量最低,而Locostatin可以增加Ⅳ型膠原蛋白表達：模型組Ⅳ型膠原蛋白相對表達量(0.21±0.04)較正常對照組(0.38±0.07)及治療組(0.68±0.04)均顯著降低(P0.01),正常對照組蛋白相對表達量較治療組顯著降低(P0.01)。3.4模型組中α-SMA蛋白表達增加,Locostatin干預可以減少HSCs的活化,降低α-SMA蛋白的表達：模型組α-SMA蛋白相對表達量(1.54±0.13)比正常對照組(0.42±0.04)及治療組(0.63±0.06)顯著升高(P0.01),治療組α-SMA蛋白表達量比正常對照組明顯升高(P0.05)。3.5 CCl4造模不會影響RKIP的表達,但Locostatin干預可以反應性的引起RKIP表達量升高：治療組RKIP蛋白的相對表達量(0.82±0.12)較模型組(0.46±0.09)均顯著增高(P0.01),正常對照組(0.29±0.05)及模型組RKIP蛋白的相對表達量無明顯差異(P0.05)。4 Locostatin通過調(diào)節(jié)MMP-13及TIMP-1的比值,促進Ⅰ型及Ⅲ型膠原降解。4.1 CCl4造�？梢越档蚑IMP-1蛋白的表達,Locostatin干預對TIMP-1蛋白含量影響不大：模型組(136.88±39.51)及治療組(140.39±24.70)TIMP-1的表達量比正常對照組(244.29±74.25)顯著降低(P0.05),模型組及治療組TIMP-1的表達無明顯差異(P0.05)。4.2.模型組中MMP-13蛋白的表達降低,Locostatin干預對MMP-13蛋白含量影響不大：模型組(23.04±4.05)及治療組(20.44±5.35)MMP-13的表達比正常對照組(31.96±8.28)明顯降低(P0.05),模型組及治療組MMP-13的表達無明顯差異(P0.05)。4.3模型組中TIMP-2蛋白的表達降低,Locostatin干預對TIMP-2蛋白含量影響不大：模型組(8.72±5.17)及治療組(9.42±3.01)TIMP-2的表達量比正常對照組(18.07±7.18)明顯降低(P0.05),模型組及治療組TIMP-2的表達無明顯差異(P0.05)。4.4模型組中MMP-2蛋白的表達降低,Locostatin干預對MMP-2蛋白含量影響不大：模型組(326.42±64.63)及治療組(342.54±66.73)MMP-2的表達量比正常對照組(700.99±245.48)顯著降低(P0.01),模型組及治療組MMP-2的表達無明顯差異(P0.05)。4.5 Locostatin可以促進膠原降解：模型組(0.17±0.02)及治療組(0.19±0.01)MMP-13/TIMP-1比值較正常對照組(0.13±0.02)顯著升高(P0.01),模型組MMP-13/TIMP-1比值比治療組顯著降低(P0.01)。4.6正常對照組(0.40±0.07)、模型組(0.39±0.02)及治療組(0.43±0.03)三組MMP-2/TMP-2相比,無明顯差異(P0.05)。結(jié)論:Locostatin可以降低CCl4誘導的肝纖維化小鼠的肝臟炎癥程度,這可能是通過Locostatin抑制炎癥細胞遷移實現(xiàn)的。其次,Locostatin通過抑制肝星狀細胞活化并增加MMP-13與TIMP-1比值,減少了Ⅰ型及Ⅲ型膠原沉積,延緩了肝纖維化進展。
【關(guān)鍵詞】：Locostatin 肝纖維化 小鼠 肝星狀細胞 RKIP 基質(zhì)金屬蛋白酶 基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-15
• 材料與方法15-30
• 結(jié)果30-36
• 附圖36-45
• 附表45-47
• 討論47-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻51-53
• 綜述 肝纖維化動物模型的制備及藥物干預方式的選擇53-62
• 參考文獻58-62
• 致謝62-63
• 個人簡歷63

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本文編號：333106