研究分為兩個部分:一、HBV cccDNA定量檢測方法的建立;二、乙肝病毒在慢性HBV感染者疾病不同階段復制特點。一、HBV cccDNA定量檢測方法的建立目的:建立一種特異性、敏感性高的乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA（HBVcccDNA）的定量檢測方法。方法:構建含HBV目的序列的重組質(zhì)粒,利用HBV cccDNA的選擇性引物/探針（簡稱71F）以及總HBV DNA引物/探針（簡稱13F）建立實時熒光定量PCR反應,分析其靈敏度、重復性和線性范圍。進一步利用重組質(zhì)粒、血清和肝組織DNA等不同模板優(yōu)選最佳PCR擴增體系,其中依據(jù)模板的不同處理方法分為無酶切組、限制性內(nèi)切酶酶切組、PSAD酶切組、限制性內(nèi)切酶聯(lián)合PSAD酶切組,比較各組對HBV cccDNA檢測的特異性。結果:通過對已有特異性檢測方法進行優(yōu)化,并針對特異性引物擴增效率和PSAD酶切等環(huán)節(jié)進行詳細探討,所建立的熒光定量檢測體系,HBV cccDNA特異性引物/探針及總HBV DNA引物/探針檢測靈敏度均達到10²拷貝/ml,兩對引物探針檢測線性范圍均為4×10²-4×10

【文章來源】：天津醫(yī)科大學天津市 211工程院校

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

質(zhì)粒構象

A﹃﹃︺圖1一3.不同濃度質(zhì)粒標準品的重復性分析。A為13F的重復檢測標準品的擴增曲線;B為7lF的重復檢測標準品的擴增曲線。1.2.2.3兩對引物的擴增效率分析參照Livak等人比較目標序列和內(nèi)參序列擴增效率的方法[‘41，利用13F與7lF在4x10”一4x102拷貝/mL范圍內(nèi)質(zhì)粒標準品的Ct值(圖1一2)，計算每一

cycleNUmberLogCOCD圖1一2.擴增曲線和標準曲線。A、B分別為13F的擴增曲線和標準曲線;C、D分別為7lF的擴增曲線和標準曲線�；谥亟M質(zhì)粒的擴增范圍，13F與7lF的空白及陰性對照始終保持檢測不到水平，因此，13F與7lF檢測下限定為1護拷貝/mL。此后的定量檢測采用4xl08一4x104拷貝/mL五個濃度制作標準曲線。1.2.2.2重復性分析批內(nèi)重復實驗:選擇濃度為4x1o”~4x103拷貝/mL的梯度稀釋質(zhì)粒標準品，分別應用13F、7lF進行熒光定量PCR檢測，每一濃度同時平行擴增3次，其Ct值的CV值分別為13F<3%、7lF<3%(圖l一3)。批間重復實驗:選擇濃度為4xlo” ~4x103拷貝/mL的梯度稀釋質(zhì)粒標準品，每一濃度分別使用13F、71F進行7個不同批次的熒光定量PCR檢測，其Ct值的CV值分別為13F<4%、71F<3%。1.倪刊刃!日.伍

【參考文獻】：
期刊論文
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