乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。HBV感染可導致肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌。HBV屬于嗜肝DNA病毒,具有部分雙鏈環(huán)狀的DNA基因組。HBV通過特有的逆轉錄反應進行復制。HBV編碼的DNA聚合酶/逆轉錄酶(DNA polymerase/Reverse transcriptase,DNA pol/RT)的結構和功能在其復制過程中起重要作用。1976年,α-干擾素(Interferon-α,IFN-α)被成功用于治療慢性乙型肝炎,它通過建立細胞內抗病毒狀態(tài)和免疫調節(jié)作用抑制并清除病毒。但臨床發(fā)現(xiàn)約2/3的患者對IFN-α治療無反應,這與HBV DNA聚合酶有關。Foster等發(fā)現(xiàn),HBV DNA聚合酶的末端蛋白(TP)可顯著抑制細胞對IFN-α反應,并認為是由TP表達阻斷IFN-α通路引起。本實驗室先前通過構建一系列基因缺失突變體方式,發(fā)現(xiàn)HBV DNA聚合酶末端蛋白+Spacer區(qū)(部分或全部)具有抗IFN-α作用,其中末端蛋白+部分Spacer區(qū)共計257個氨基酸(TP257)抗IFN-α作用尤為明顯,但其機制尚不清楚。本研究擬應用AdEasy XL Adenoviral Vector System表達TP257蛋白并通過免疫沉淀篩選與相互作用的細胞蛋白,初步探討HBV DNA聚合酶TP區(qū)IFN-α作用機制,為研制新的抗HBV藥物提供新的思路。 為包裝重組腺病毒AD-TP257,并在Huh7細胞中獲得表達,首先構建穿梭載體pShuttle-IRES-hrGFP-TP257,并重組到腺病毒骨架載體pADEasy-1,通過293A細胞包裝重組腺病毒,感染人肝癌細胞Huh7,Western-blot驗證TP257蛋白表達;為篩選與TP257抗干擾素效應相關細胞蛋白,分別在重組腺病毒感染細胞前或感染細胞后加入IFN-α,收獲細胞蛋白進行免疫沉淀,通過質譜鑒定差異蛋白。實驗結果表明重組腺病毒AD-TP257能有效感染Huh7細胞并大量表達TP257蛋白;重組腺病毒AD-TP257感染細胞后加入IFN-α并通過免疫沉淀篩選到三種候選差異蛋白,經質譜鑒定分別為:熱休克蛋白60、組蛋白HIST1H2BC和肌凝蛋白調節(jié)輕鏈12A。因此,TP257可能通過上述蛋白影響病毒的抗干擾素效應。
【學位單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

材料和方法料來源、質粒、菌株和細胞 編碼 HBV DNA 聚合酶末端蛋白+部分 Spacer 257 個氨基酸 (TP257) 的重組質粒 pNTAPB-TP257 由本實驗室構建和空載體重組腺病毒 AD-GFP 由本實驗室包裝和保存；AdEasy XLiral Vector System 購自 Stratagene 公司，包括 pShuttle-IRES-hrGFP-1pADEasy-1 、BJ5183-Ad-1 和 XL-10 gold 菌株；大腸桿菌 DH5α 由本保存；Huh7 細胞購自 ATCC，293A 購自 Invitrogen 公司。

丙烯酰胺、SDS 、甘氨酸和三羥甲基胺基甲烷 (Tris) 等化學試劑為國產分析純；PVDF 膜購自 Amersham 公司， Cocktail 蛋白酶抑制劑和 CDP-Star 購自Roche 公司；RIPA 蛋白裂解液及 BCA 蛋白質定量試劑盒購自碧云天公司；Monoclonal ANTI-FLAG M2 Antibody 購自 Sigma 公司，帶 AP 標簽的羊抗鼠二抗體購自 Santa Cruz 公司；引物由上海博尚生物技術有限公司合成。2.實驗方法2.1 構建重組腺病毒流程 (圖 2)

2.2.1 pShuttle-IRES-hrGFP-TP257 載體的構建：(1) PCR 擴增 TP257 全長：以質粒 pNTAPB-TP257 為模板，使用 Platinum TaqDNA Polymerase ， 進 行 TP257 基 因 片 段 ( 圖 3) ， 所 用 引 物 序 列 為TP257shuIRESF-2：5'-ATAAGAATGCGGCCGCGCCACCATGCCCCTATCTTATCAA-3' ( 下劃線為 Not I 位點，方框內為 Kozak 序列 ) ， TP257shuIRESR ： 5'ACGCGTCGACCCACCCCAAAAGACCGCCGTGT -3' (下劃線為Sal I位點) ，引物由上海博尚公司合成。擴增采用熱啟動方式，即：反應先經 95 °C 預變性5min，待溫度上升至 80 °C 后加入聚合酶，隨后進入循環(huán)。
【參考文獻】

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1 王林;柏世玉;陳婉南;李暉;林建銀;林旭;;乙型肝炎病毒DNA聚合酶末端蛋白抗α-干擾素功能區(qū)域分析[J];中華微生物學和免疫學雜志;2007年06期

本文編號：2890072