本研究通過(guò)選用不同生物及化學(xué)分化體系對(duì)由大鼠2-AAF/PH　模型分離出的肝卵圓細(xì)胞及WB-F344　細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo),誘導(dǎo)細(xì)胞肝、膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)上調(diào),干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)減弱或消失,形態(tài)學(xué)也發(fā)生相應(yīng)改變,實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)肝前體細(xì)胞可控的向肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞分化。同時(shí)我們通過(guò)聯(lián)合運(yùn)用iTRAQ技術(shù)及質(zhì)譜技術(shù)研究肝WB-F344細(xì)胞在體外向膽管細(xì)胞分化過(guò)程中的差異蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá),篩選與分化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)及可能做為卵圓細(xì)胞特異標(biāo)志物的蛋白。質(zhì)譜結(jié)果鑒定出了1278個(gè)差異蛋白,對(duì)67個(gè)發(fā)生明顯上調(diào)或下調(diào)的蛋白進(jìn)行了鑒定及功能學(xué)檢測(cè)。本研究表明ITRAQ技術(shù)是研究培養(yǎng)細(xì)胞動(dòng)態(tài)差異蛋白組學(xué)的有效方法,檢驗(yàn)出的差異蛋白可能與卵圓細(xì)胞向膽管上皮細(xì)胞分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)�！�
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2007
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

一、大鼠 2-AFF/PH 模型分離肝卵圓細(xì)胞的特征：2-AFF灌喂大鼠在行2/3肝切除術(shù)后約4－12天內(nèi)可見膽管增生反應(yīng)和膽管周圍的卵圓細(xì)胞反應(yīng)，于第9 天達(dá)到最明顯。卵圓細(xì)胞增生部位多位于匯管區(qū)及小葉間膽管附近，所見到的肝卵圓細(xì)胞體積較小，卵圓細(xì)胞核呈卵圓形，胞質(zhì)較少，嗜酸性弱，肝卵圓細(xì)胞大小及分布不均勻(圖1-A、B)。呈簇狀分布且由匯管區(qū)向肝實(shí)質(zhì)內(nèi)延伸。經(jīng)二部膠原酶消化法分離出的細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，5 天后我們即可見克隆樣生長(zhǎng)的上皮樣細(xì)胞(圖1-C)形體小，核漿比例大，細(xì)胞折光性強(qiáng)。經(jīng)純化后卵圓細(xì)胞記為第一代，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%滿時(shí)1:3 傳代,約3－5 天傳一代。相差顯微鏡觀察細(xì)胞直徑約10-15μm，呈鋪路石樣排列多角形。形態(tài)較均一，折光性強(qiáng)，核大，卵圓形，胞漿少，核仁明顯，細(xì)胞之間有接觸抑制(圖1-D)。細(xì)胞融合培養(yǎng)時(shí)可見迅速消亡。

且抑制作用隨濃度增高及作用時(shí)間延長(zhǎng)，而 0.75、2.25mmol/L 作用組丁酸鈉其光密度值與對(duì)照組無(wú)明顯差別（圖 1-2A）；6.25mmol/L 丁酸鈉誘導(dǎo)組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不佳，培養(yǎng)第 2 天即可見到較多細(xì)胞脫壁死亡，殘余折光性弱，邊界模糊(圖 1-2B)。在以下分化實(shí)驗(yàn)中我們選取 3.75 和 5.25mmol/L 丁酸鈉進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。幾種分化體系對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞均有抑制作用，其抑制作用在卵圓細(xì)胞和 WB－F344 細(xì)胞間無(wú)明顯區(qū)別。圖 1-3 為卵圓細(xì)胞在各分化體系中的生長(zhǎng)曲線圖:丁酸鈉體系對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，顯微鏡下觀察該體系內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組；HGF+EGF 體系對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制最低，鏡下可發(fā)現(xiàn)卵圓細(xì)胞在該體系中形態(tài)于數(shù)量與對(duì)照組無(wú)明顯區(qū)別，WB-F344 細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變的細(xì)胞較多，但周圍仍可觀察到較多相對(duì)正常的細(xì)胞。

圖 1-3 不同分化體系作用于卵圓細(xì)胞后細(xì)胞的增殖情況（二）分化體系對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響卵圓細(xì)胞在丁酸鈉誘導(dǎo)下，處理 2 天后相差顯微鏡顯示細(xì)胞形態(tài)展面積增大，生長(zhǎng)停止，細(xì)胞核變大，胞漿也相應(yīng)增加，核漿比減�。˙）。第三天可見出現(xiàn)雙核或多核細(xì)胞第七天基本上見不到鋪路石樣卵圓3.75、4.5 mmol/L 的丁酸鈉誘導(dǎo)的 WB-F344 細(xì)胞形態(tài)改變與卵圓細(xì)胞處理 1 天后相差顯微鏡顯示 WB-F344 細(xì)胞形態(tài)變平，大小要略小于誘卵圓細(xì)胞，細(xì)胞成圓形或橢圓形，生長(zhǎng)減慢，細(xì)胞間距離增大，細(xì)胞核核質(zhì)比減小，5 天基本上見不到原始狀態(tài)的 WB-F344 細(xì)胞（圖 1-5 C）。在 Matrigel 上培養(yǎng)的卵圓細(xì)胞和 WB－F344 細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上有均變，相差顯微鏡顯示培養(yǎng)第 2 天細(xì)胞間可見到繩索樣結(jié)構(gòu)，由拉伸成的細(xì)胞組成；其余細(xì)胞的生長(zhǎng)停止，細(xì)胞呈島樣聚集。相對(duì)對(duì)照細(xì)胞，
【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 林滿洲;李明意;;肝卵圓細(xì)胞分化潛能的研究進(jìn)展及應(yīng)用前景[J];廣東醫(yī)學(xué);2008年11期

2 唐慶賀;徐峰;李愛軍;談冶雄;周偉平;;基于iTRAQ技術(shù)的WB-F344細(xì)胞向膽管細(xì)胞分化過(guò)程中的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J];肝膽外科雜志;2011年06期

3 潘德盛;蔡兵;;肝干細(xì)胞移植治療終末期肝病的進(jìn)展[J];肝膽胰外科雜志;2010年02期

4 陶連元;何小東;蔡磊;;膽管細(xì)胞癌危險(xiǎn)因素研究進(jìn)展[J];肝膽胰外科雜志;2010年03期

5 黃利華;郭姣;黃珮;紀(jì)超;貝偉劍;鄧曉君;;新生大鼠肝干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定[J];廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào);2010年04期

6 John P.Hunt;Heike Varnholt;;Mixed hepatocellular-cholangiocarcinoma may derive from "hepatogones"[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2008年01期

7 ;Risk factors for early recurrence of small hepatocellular carcinoma after curative resection[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2010年01期

8 呂剛;衛(wèi)立辛;蒲永東;吳孟超;;不同來(lái)源肝干細(xì)胞的分選方法[J];中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展;2010年04期

9 趙麗娟;余嬌;李影;陳奕;夏芳珍;王寧薦;陸穎理;;不同品系大鼠肝臟卵圓細(xì)胞增殖模型的比較研究[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年04期

10 魯學(xué)恒;劉沛;;肝干細(xì)胞相關(guān)研究進(jìn)展[J];中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志;2006年11期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 羅丁;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合α-干擾素對(duì)大鼠肝損傷的治療作用[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年

2 沈永杰;大豆黃酮和酸性肽對(duì)人肝癌SMMC7721細(xì)胞增殖及腫瘤干細(xì)胞CD133表達(dá)的影響[D];鄭州大學(xué);2011年

3 賀司宇;Mung、Gin、L08對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC7721及其腫瘤干細(xì)胞CD133表達(dá)的抑制作用[D];鄭州大學(xué);2011年

4 常洞鐳;HBV對(duì)卵圓細(xì)胞的作用及對(duì)P8的表達(dá)影響[D];華中科技大學(xué);2011年

5 劉翠萍;體外聯(lián)合化療對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞株CD90/CD44表達(dá)的影響及意義研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年

6 陳鐵軍;利用大鼠Y染色體特異性PCR技術(shù)檢測(cè)卵圓細(xì)胞源性肝癌細(xì)胞[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2006年

7 李曉敏;水流動(dòng)力學(xué)注射介導(dǎo)的白細(xì)胞介素-12基因在小鼠體內(nèi)的高效表達(dá)[D];吉林大學(xué);2006年

8 張磊;抗氧化劑吡咯烷二硫代氨基甲酸（PDTC）對(duì)卵巢癌細(xì)胞HO8910增殖、凋亡的影響及機(jī)制的研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2007年

9 高鴿;原發(fā)性肝細(xì)胞癌及癌旁組織中CK7和CK19的表達(dá)及意義[D];延邊大學(xué);2007年

10 趙振云;烏龜原代細(xì)胞培養(yǎng)及其對(duì)電離輻射抗性的初步研究[D];暨南大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2882799