發(fā)布時間：2020-11-13 20:35

　　 第一部分KIR和HLA-C基因多態(tài)性與慢性乙肝相關性的研究 研究背景 慢性乙肝(CHB)是肝硬化和原發(fā)性肝癌的主要原因,世界上患有CHB的人數(shù)超過3.5億,而且四分之三的CHB病人在中國。然而,CHB發(fā)生的原因至今尚不完全清楚。目前,宿主遺傳因素受到重視,被認為是導致病毒持續(xù)存在的主要原因。由于宿主的免疫反應對病原體感染的結局起著關鍵的作用,因而許多研究都集中在免疫反應基因上。而且,免疫反應基因如人類白細胞抗原一類(HLA-I)和二類(1I)基因在人類基因組中顯示最高度的多態(tài)性,是研究其與乙肝病毒感染結局相關性的理想的候選基因。然而,以前研究報道的HLA多態(tài)位點和HBV感染臨床結局間的相關性,在不同種族人群中的結果很不一致。因此,免疫反應中其它遺傳因素可能在CHB的發(fā)生中發(fā)揮作用。 殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIRs)基因具有多基因性和多態(tài)性,它們編碼的分子主要表達在自然殺傷細胞(NK)和某些T細胞亞群上。NK細胞在先天性抗病毒感染免疫反應中發(fā)揮主要作用,部分是通過KIRs與表達在感染宿主細胞上它們的HLA-I類配體的相互作用。與NK細胞上KIRs識別特別相關的是多態(tài)性的HLA-C分子。功能性KIR基因編碼活化性和抑制性受體。迄今為止,已確定的人KIRs基因總共有17個,其中9個是NK細胞抑制性的(KIR2DL1-4,2DL5A,2DL5B,3DL1-3),6個是活化性的(KIR2DS1-5,3DS1),2個是假基因(KIR2DP1,3DP1)。另外,不同的KIR基因組合在一起形成可遺傳的單體型。盡管這些單體型在包含基因的數(shù)量和種類上各不相同,然而,通常根據(jù)基因成分的不同,KIR單體型能被分成兩個基本類別,即A類和B類。A類比B類簡單,含有較多的抑制性基因,而B類單體型KIR基因的數(shù)目變化較大,其中更多的基因編碼活化性KIR。至今,已公布的不同的B類單體型超過20種�，F(xiàn)已明確,個體間含有不同數(shù)量的KIR抑制性和活化性基因。 KIRs對HLA-C配體分子的識別依賴于HLA-C分子的結構基礎。多態(tài)性的HLA-C等位基因根據(jù)HLA-C分子上80位的氨基酸是天冬酰胺(Asn80)還是賴氨酸(Lys80)表位,大體上可分成C1型和C2型。一些KIRs現(xiàn)已明確具有HLA-C識別特異性。KIR2DL1和KIR2DS1結合含有Lys80的HLA-C分子(HLA-C2),而KIR2DL2、KIR2DL3和KIR2DS2則識別含有Asn80的HLA-C分子(HLA-C1)。 NK細胞的活性不但受抑制性受體,而且受活化性受體的調節(jié),這些受體識別靶細胞上的HLA-C分子。因此,抑制信號和活化信號博弈的最終結果可能控制NK細胞殺傷脅迫細胞的能力。在體內,NK細胞在受體構成上處于抑制性受體的控制之下。因而,僅當活化信號的作用超越抑制信號時,NK細胞才能發(fā)揮效應功能。由于KIR和HLA基因的高度多態(tài)性以及它們各自獨立的分布特點,加之KIR對特定HLA同種異型分子識別的特異性,個體間會出現(xiàn)各種不同的受體／配體組合譜型。這些HLA/KIR組合可能會相應地導致NK細胞活化閾值的差異。因此,人群中由這些遺傳下來的多態(tài)性基因所決定的不同配體／受體組合可使效應細胞表現(xiàn)不同的功能,這能強烈影響個體對疾病的易感性。此前的幾項研究表明,KIR受體／配體組合參與不同種類疾病的發(fā)生和發(fā)展。一項KIR2DL3和HLA-C1相互作用對丙型肝炎病毒(HCV)感染影響的研究顯示,NK細胞的抑制性降低對HCV的感染具有保護作用。因此,在本研究中,我們假設KIR/HLA-C組合與CHB的發(fā)生可能也具有相關性。 目的 通過比較等位基因、基因型、單體型以及KIR/HLA-C組合頻率在CHB病例組與對照組中的分布,探討多態(tài)性HLA-C、KIR基因和KIR/HLA-C基因組合與CHB的相關性。 研究方法 研究對象：本研究依據(jù)CHB的診斷標準選擇CHB患者182例(男性100例,女性82例),同時選擇140例健康個體(男性75例,女性65例)作為對照。兩組個體均來自于同一種族。所有個體沒有HCV、丁型肝炎病毒以及HIV感染的血清學證據(jù),也無其它如糖尿病、惡性腫瘤和自身免疫性疾病。本研究經山東大學附屬省立醫(yī)院倫理委員會批準及參與者的知情同意。 基因分型：通過序列特異性引物聚合酶鏈式反應(PCR-SSP)對HLA-C等位基因和KIR基因進行基因分型。采用DRB1的基因片段作為陽性對照,同時每一批擴增反應都包含陰性對照。對PCR-SSP基因分型標本的10%及少數(shù)不能確定結果的標本,結合KIR的HLA-C80位置處的特異性基序通過基因測序確證。除2DS5外,所有KIR基因位點都采用兩套引物,以確保KIR基因分型的準確性。根據(jù)Witt等和Hsu等建立的模型確定KIR的基因型和單體型。 統(tǒng)計學分析：Hardy-Weinberg遺傳平衡的檢驗使用χ2檢驗。病例組與對照組之間等位基因、基因型、單體型和KIR/HLA-C基因組合頻率的比較采用χ2檢驗,必要時使用Fisher確切概率檢驗。 結果 1.在CHB病例組和對照組之間,HLA-C等位基因分布相似,各等位基因頻率沒有顯著差異；而在CHB組中,HLA-C2等位基因的頻率明顯高于對照組(P=0.006)。 2.在CHB病例組中,HLA-C1C1純合基因型的頻率明顯低于對照組(P=0.01)。 3.在CHB病例組和對照組之間,KIR基因、單體型和基因型的分布沒有顯著差異。 4.在CHB病例組中,KIR2DL1與HLA-C2組合的頻率明顯高于對照組(P=0.013)。 5.在CHB病例組中,KIR2DL3或KIR2DL3純合型與HLA-C1C1組合的頻率明顯低于對照組(分別為P=0.011和P=0.024)。 結論 1.抑制性受體KIR2DL1與HLA-C2配體的組合是CHB的易感因素。 2.抑制性受體KIR2DL3或KIR2DL3純合型與HLA-C1C1配體的組合是CHB的保護性因素。 第二部分HBV轉基因鼠單核細胞基因表達譜分析 研究背景 乙型肝炎病毒(HBV)屬于嗜肝DNA病毒科,是引起乙型病毒性肝炎的病原體。肝臟是HBV的主要復制器官,但HBV感染并不僅限于肝細胞,HBV感染也存在于骨髓和外周血單個核細胞。雖然在急、慢性乙肝患者外周血B細胞、單核細胞(Mo)、CD4+和CD8+T細胞和NK細胞均可檢測到HBV的DNA和RNA,但Mo和B細胞的病毒載量和感染率明顯高于其它淋巴細胞。 近年來HBV感染和自身免疫性疾病關聯(lián)性的研究取得較大進展。臨床和實驗研究顯示,某些感染如HBV可能保護易感個體發(fā)生自身免疫性疾病(SLE和多發(fā)性硬化)。臨床研究發(fā)現(xiàn),慢性HBV感染合并SLE患者狼瘡活動性、蛋白尿和抗dsDNA抗體滴度均明顯低于非合并慢性乙肝(CHB)的SLE患者。以上發(fā)現(xiàn)提示HBV感染和SLE之間存在關聯(lián)性,HBV感染可能對SLE的發(fā)生發(fā)展具有拮抗(保護)作用,但缺乏充分實驗依據(jù)。我們在前期研究中以降植烷(pristane)誘導的狼瘡鼠為模型,初步探討了HBV感染是否對SLE具有保護作用及其可能的機制。我們的腎組織病理和血清學結果均顯示HBV能減輕pristane誘導狼瘡樣小鼠的病理損傷,對SLE具有保護作用。根據(jù)既往研究報道和我們的前期研究發(fā)現(xiàn),推測HBV感染對SLE可能保護作用的機制是：①抑制Mo異�；罨虰AFF、TNF-α產生；②抑制B細胞活化和自身抗體分泌；③促進T細胞分泌IL-2和抑制其IL-17的產生 單核細胞作為固有免疫系統(tǒng)的主要組分,承擔啟動炎癥、產生細胞因子、募集其它免疫細胞、吞噬和抗原呈遞等多種免疫功能,它將先天性和固有免疫系統(tǒng)聯(lián)系起來。近來的研究發(fā)現(xiàn)紅斑狼瘡患者的單核細胞／巨噬細胞有表面蛋白表達、細胞因子產生以及吞噬等功能的缺陷。單核細胞功能異常越來越被認為在各種自身免疫性疾病特別是SLE的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 HBV感染可影響單核細胞的基因表達,鑒于單核細胞在SLE發(fā)生機制中的重要作用,單核細胞的功能改變可能影響SLE的發(fā)生及病理進程。幾項HBV感染與SLE關系的研究結果提示,HBV感染可能通過改變單核細胞的功能來影響SLE的發(fā)生發(fā)展。然而,HBV感染對Mo基因表達譜的影響目前尚不清楚。在本研究中,我們應用HBV轉基因鼠模型探討HBV感染對單核細胞基因表達的影響。 目的 通過對HBV轉基因鼠和對照鼠脾單核細胞基因表達譜的比較,分析HBV感染單核細胞的差異表達基因；探索單核細胞免疫相關基因表達變化在SLE發(fā)生發(fā)展中的作用,為進一步闡明HBV感染與SLE的關系提供依據(jù)。 研究方法 摘除雌性HBV轉基因BALB/c小鼠與對照BALB/c小鼠的脾臟,制備脾單細胞懸液,分離單個核細胞。用磁分選法從脾單個核細胞中分離Mo。提取總RNA。在基因芯片分析系統(tǒng)上進行cRNA的合成、標記、芯片雜交,掃描、資料獲取和分析。分析實驗組與對照組各個探針位點熒光強度的比值(Ratio值)。Ratio值大于2.0時被認為有顯著表達差異。 結果 1.HBV轉基因鼠與對照鼠相比,脾單核細胞轉錄表達有差異的基因共計125個,其中表達升高的有99個,表達降低的有26個。表達有差異的基因中與免疫相關的有10個,腫瘤相關的10個,信號通路相關的3個,細胞代謝相關的16個,離子通道相關的3個,細胞凋亡相關的2個,轉錄相關的5個,神經系統(tǒng)功能相關的8個,與某些疾病相關的有11個以及功能不明確的基因57個。 2.與對照鼠相比,HBV轉基因鼠脾單核細胞免疫相關的差異表達基因中,上調表達的有7個,下調表達的有3個。上調表達的基因包括幾個免疫球蛋白結構域基因、干擾素誘導基因、C反應蛋白樣基因(APC)以及Fas相關的基因(FADD);下調表達的基因包括G蛋白偶聯(lián)受體基因、G蛋白信號傳導調節(jié)因子基因以及趨化因子配體基因(CXCL2)。 結論 1.HBV感染可改變單核細胞的基因表達譜。HBV感染單核細胞的差異表達基因參與免疫、信號轉導和細胞代謝等多種功能。 2.HBV感染單核細胞中免疫相關基因APC和FADD的上調表達以及CXCL2的下調表達,可降低自身免疫反應,減弱IFN-α的作用以及細胞介導的炎癥反應,表明HBV感染可能通過改變這些基因在單核細胞內的表達對SLE起保護作用。
【學位單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2012
【中圖分類】：R512.62
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
符號說明
第一部分 KIR和HLA-C基因多態(tài)性與慢性乙肝相關性的研究
    前言
    材料與方法
    結果
    討論
    結論
    參考文獻
第二部分 HBV轉基因鼠單核細胞基因表達譜分析
    前言
    材料與方法
    結果
    討論
    結論
    參考文獻
附圖
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文
學位論文評閱及答辯情況表
外文論文1
外文論文2

【共引文獻】

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2 張麗煌;趙亮;阮標;;HLA與鼻咽癌易感風險的研究進展[J];醫(yī)學綜述;2011年09期

3 陳龍;羅雄燕;吳鳳霞;袁國華;;乙型肝炎病毒與自身免疫病的發(fā)病關系[J];中華實驗和臨床感染病雜志(電子版);2011年02期

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2 劉曉雯;HBV對實驗性狼瘡的保護作用及其機制[D];山東大學;2012年

3 白艷艷;KIR與SLE和ReA發(fā)病機制的相關研究及HIC1對SMG生長發(fā)育影響的分析[D];山東大學;2013年

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1 張麗煌;Survivin,Bcl-2,Pml mRNA的表達及其與鼻咽癌臨床分期及預后的關系[D];昆明醫(yī)學院;2011年

2 徐東兵;中國HIV-1感染者KIR及HLA-Bw4基因與疾病進展關系的研究[D];中國醫(yī)科大學;2008年

3 王小鳳;系統(tǒng)性紅斑狼瘡、強直性脊柱炎、類風濕關節(jié)炎患者乙型肝炎病毒感染狀況及其臨床意義[D];山東大學;2014年

本文編號：2882616