目的:探討乳脂球表皮生長因子-8(milk fat globule-epidermal growth factor-8,MFG-E8)在非酒精脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)中的作用及其潛在機制。方法:將24只野生型(wild type,WT)和MFG-E8基因敲除(knock out,KO)C57BL/6小鼠隨機分成4組(CD-WT組、MCD-WT組、CD-KO組和MCD-KO組)。其中CD-WT組和CD-KO組給予對照飼料(control diet,CD)飲食;MCD-WT組和MCD-KO組給予蛋氨酸和膽堿缺乏模型飼料(methionine and choline deficient diet,MCD)飲食。期間密切觀察小鼠身體狀態(tài),并每周固定時間測量記錄其體重。5周后收取小鼠血液和肝臟組織。試劑盒檢測血清中的丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,AST)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)的活性水平,肝臟組織中的甘油三酯(triglyceride,TG)含量;蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色檢測評估肝臟病理學變化;油紅O染色評價肝臟脂肪變性程度;天狼星紅和馬森三色染色評估肝臟纖維化程度;免疫熒光染色檢測肝臟中巨噬細胞(F4/80)和中性粒細胞(Ly6G)募集和浸潤情況;酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-lineked immunosorbent assay,ELISA)檢測肝組織中細胞因子TNF-?和IL-1?蛋白的表達;實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(quantitatative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測肝組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM、CCL_2、CXCL_2和TGF-?細胞因子mRNA的表達;免疫蛋白印跡法(western blot,WB)檢測肝臟組織中TLR4信號通路中TLR4、p-IRAK1、p-p38、p-p65和p65蛋白表達。結果:1.與CD-WT組相比,MCD-WT組小鼠血清中ALT、AST的活性水平、肝組織TG含量顯著增高,肝臟病理損傷和脂肪變性、肝臟纖維化程度加重,肝臟巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤增加,肝組織內細胞因子TNF-α和IL-1β蛋白及TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM、CCL_2、CXCL_2和TGF-βmRNA的表達增多,TLR4相關通路TLR4、p-IRAK1、p-p38、p-p65和p65蛋白的表達上調。2.與MCD-WT組相比,MCD-KO組小鼠血清ALT、AST的活性水平及肝組織TG含量增高,肝臟脂肪變性、纖維化程度加重,巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤增加,細胞因子TNF-α和IL-1β蛋白水平及TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM、CCL_2、CXCL_2和TGF-βmRNA的表達均上調,TLR4通路TLR4、p-IRAK1、p-p38、p-p65和p65等相關蛋白的表達增加。結論:MFG-E8基因敲除促進非酒精脂肪性肝炎的發(fā)展,這可能與其增加炎癥細胞因子的釋放,增加炎性細胞的的浸潤,活化TLR4信號相關通路,擴大炎癥級聯(lián)反應有關。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R575.5
【部分圖文】：

1.2.12 統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)以 X ±SD來表示，采用單因素方差分析或 t 檢驗進行統(tǒng)計分析， p＜ 0.05 時具有統(tǒng)計學意義。2 結果2.1 MFG-E8 基因敲除增加 NASH 小鼠血清中 ALT 和 AST 的活性血清 ALT 和 AST 活性是評價肝臟功能損傷的指標，如圖 1 所示，與 CD-WT組相比，MCD-WT 組小鼠血清中的 ALT 和 AST 活性水平顯著增加（p＜0.01）。與 MCD-WT 組相比，MCD 組小鼠血清中的 ALT 和 AST 活性水平顯著增加（p＜0.01）。

重慶醫(yī)科大學碩士研究生學位論文2.2 MFG-E8 基因敲除加重 NASH 小鼠肝臟的病理學損傷如圖 2A HE 染色結果所示， CD-WT 組和 CD-KO 組小鼠肝組織結構完整，肝小葉完整，肝板正常，肝細胞圍繞中央靜脈呈條索狀排列。與 CD-WT 組相比，MCD-WT 小鼠肝臟組織肝小葉完整性被破壞，肝細胞排列紊亂，大部分肝細胞核被擠到細胞邊緣呈明顯的空泡狀，并伴隨大量炎癥細胞浸潤。與MCD-WT組相比，MCD-KO 組小鼠脂肪空泡更大更多，炎癥細胞大多匯聚在匯管區(qū)，有的可見炎癥細胞團凝集，胞漿疏松化更嚴重。如圖2B NAS評分所示，與CD-WT組相比，MCD-WT 脂肪變性、炎癥和氣球樣變加重，通過 NAS 評分系統(tǒng)的可得出MCD-WT 組小鼠已患 NASH。與 MCD-WT 組相比，MCD-KO 組小鼠脂肪變性、炎癥和氣球樣變更嚴重，通過 NAS 評分系統(tǒng)的可得出 MCD-KO 更加嚴重。

圖 3.MFG-E8 加重 NASH 小鼠肝臟脂肪變性Fig 3. MFG-E8 aggravates hepatic steatosis in NASH miceO 染色結果×200 B: 肝 TG 水平（與 CD-WT 相比##P＜0.01 ，與 MCD相比**P＜0.01）G-E8 基因敲除加重 NASH 小鼠肝臟的纖維化4A，馬森三色染色所示，與CD-WT組相比，MCD-WT組小鼠肝臟增加，紅色胞漿減少，與 MCD-WT 組相比，MCD-KO 組小鼠膠原更多紅色胞漿減少。如圖 4B，天狼星紅染色所示，與 CD-WT 組相T 組小鼠肝臟紅色膠原纖維增加，與 MCD-WT 組相比，MCD-KO 組纖維染色更多，圖中也可看出脂肪空泡增多。
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