研究背景和目的丙型病毒性肝炎是一種嚴重威脅人類健康的傳染性疾病,在世界范圍內(nèi)廣泛流行,目前全球大約有1.85億人感染丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)。HCV感染后有74-86%的人發(fā)展為以肝纖維化為主要特征的慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C virus,CHC),并有潛在發(fā)展為肝硬化和肝細胞癌傾向。中國人群HCV感染率為3.2%,HCV感染在中國已經(jīng)成為乙型病毒性肝炎、結(jié)核、痢疾之后第四大傳染性疾病,尤其是35歲以上人群的HCV感染率持續(xù)增長,嚴重威脅著個人健康,給家庭和社會造成了沉重的經(jīng)濟負擔。目前抗病毒治療是慢性丙型肝炎唯一有效的治療手段。自2011年直接作用抗病毒(direct acting antivirals,DAAs)藥物問世以來,丙型肝炎的治療取得了突破性進展。研究顯示,在西方發(fā)達國家,HCV NS5B核苷酸類似物sofosbuvir聯(lián)合利巴韋林或其他抗病毒藥物能夠治愈90%的HCV感染者。然而,由于價格昂貴,sofosbuvir等核苷酸類似物抗HCV藥物在我國至今仍未上市,基于干擾素聯(lián)合利巴韋林的抗病毒治療方案目前仍是中國和一些發(fā)展中國家公認的治療慢性丙型肝炎的首選藥物。然而,按照傳統(tǒng)的聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療,仍會有將近50%的CHC患者不能獲得持久病毒學應(yīng)答(sustained virological response,SVR)。因此,篩選影響抗病毒治療療效的可能因素,完善抗病毒治療方案就顯得尤為重要。髓源抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是由骨髓祖細胞和非成熟的髓樣細胞組成的異質(zhì)細胞群體,包括不成熟粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)等。其共同的特征是:骨髓起源、未成熟狀態(tài)和顯著的T細胞抑制功能。MDSCs在人體內(nèi)主要出現(xiàn)在外周血中。最近研究顯示髓源抑制細胞可以在腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染性疾病中大量積聚,并與疾病的不良預(yù)后有密切關(guān)系。當發(fā)生微生物、寄生蟲或病毒感染、化療、自身免疫性疾病、應(yīng)激以后,均會促進MDSCs增多。一項研究顯示HCV慢性感染可以誘導(dǎo)MDSCs的增長,該群細胞能夠有效抑制CD4+和CD8+T細胞的增殖和IFN-γ的產(chǎn)生,導(dǎo)致HCV感染的慢性化。最近的報道顯示抗HCV病毒治療后,HCV慢性感染者血液中的HCV病毒載量與MDSCs具有相同的下降趨勢,證明HCV病毒能夠促進MDSCs的產(chǎn)生。大量研究已證實MDSCs數(shù)量的增長與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān),但MDSCs與丙型肝炎患者抗病毒治療臨床預(yù)后的關(guān)系尚不十分清楚。本次研究重點了解髓源抑制細胞對CHC患者干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療臨床預(yù)后的影響及其潛在的機制。研究材料與方法 1研究材料2011年6月至2013年6月間,鄭州大學第一附屬醫(yī)院感染科和消化內(nèi)科收治的初治慢性丙型肝炎感染者共計206例(血清檢測HCV RNA和HCV抗體均陽性,既往未接受過干擾素聯(lián)合利巴韋林治療),均接受標準療程聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療(PEG-IFN/RBV),停藥隨訪24周。所有患者排除以下情況:妊娠或哺乳期婦女,酒精性肝病、藥物性肝病、以及失代償期肝硬化者,合并其他肝炎病毒及艾滋病感染者,6個月內(nèi)接受過免疫抑制劑治療者,自身免疫性疾病患者,嚴重精神性疾病特別是抑郁癥患者,惡性腫瘤、甲狀腺疾病及吸毒或酗酒者,嚴重心腦血管疾病患者。共有180例病例最終完成整個治療和隨訪計劃、資料齊全,被納入統(tǒng)計分析。其中127例獲得持久病毒學應(yīng)答(SVR),53例未獲得持久病毒學應(yīng)答(Non-SVR)。20例健康人組成健康對照組。2研究方法本次研究采用巢式病例對照研究方法,從病例就診住院跟蹤隨訪到治療停藥滿24周,觀察SVR獲得情況。未獲得SVR的病例為病例組,獲得SVR的病例為對照組。隨訪觀察和收集了所有病例的人口學特征、臨床病理參數(shù)以及接受PEG-IFN/RBV治療療效的相關(guān)數(shù)據(jù);采集初治慢性丙型肝炎患者PEG-IFN/RBV抗病毒治療前后外周靜脈血10ml,密度梯度離心法獲得單個核細胞,流式細胞儀(FACS)檢測HLA-DR-/lowCD33+CD14+CD11b+cell(M-MDSC)和HLA-DR-/lowCD33+CD14-CD11b+cell(G-MDSC)細胞含量及STAT3表達水平、CD4+T和CD8+T細胞增殖、功能、細胞周期和表型;采用流式細胞儀分選純化M-MDSC和G-MDSC,q RT-PCR檢測兩群細胞免疫抑制性基因表達;MDSC與磁珠分選的CD4+T和CD8+T細胞共孵育,研究其對T細胞免疫抑制功能及表型變化的影響。使用EPIDATA3.0建立數(shù)據(jù)庫錄入數(shù)據(jù)。應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件(version 16.0;SPSS Inc,Chicago,IL,USA)和Graph Pad Prism software(version 5.0;San Diego,CA,USA)處理分析數(shù)據(jù)。定量資料符合正態(tài)分布時采用x±s表示,采用One-Way ANOVA test比較兩組間變量差異,多組間變量比較采用Student-Newman-Keuls(SNK)檢驗;不符合正態(tài)分布時采用中位數(shù)和區(qū)間表示,使用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗分析兩組間變量差異,Kruskal-Wallis H檢驗分析多組間變量差異,兩兩組間比較采用Nemenyi method檢驗。定性資料使用絕對數(shù)或百分比表示,根據(jù)需要采用Chi-square檢驗或Fisher’s exact probability檢驗變量的組間差異。采用Pearson相關(guān)或Spearman相關(guān)分析變量間線性相關(guān)關(guān)系,采用單因素二分類Logistic回歸篩選影響HCV感染者干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療預(yù)后的影響因素,將有統(tǒng)計學意義的變量放入多因素二分類Logistic回歸分析,確定影響CHC患者抗病毒治療預(yù)后的獨立危險因素。采用Receiver operating characteristic curve(ROC)分析確定MDSCs預(yù)測SVR的最佳診斷界值(cut-off值)。采用雙側(cè)檢驗,檢驗水準α=0.05。研究結(jié)果 第一部分影響慢性丙型肝炎患者抗病毒治療預(yù)后因素研究1 206例初治CHC患者納入研究隊列,其中180例完成標準抗病毒治療和隨訪,SVR應(yīng)答率為70.6%;2根據(jù)MDSCs表型,將其分為G-MDSCs(HLA-DR-/lowCD33+CD14-CD11b+)和M-MDSCs(HLA-DR-/lowCD33+CD14+CD11b+),Non-SVR組G-MDSCs顯著高于SVR組和健康對照(P0.05),三組M-MDSCs差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);3 G-MDSCs與HCV RNA載量(r=0.41,P0.01)、ALT(r=0.51,P0.01)、AST(r=0.46,P0.01)、LSM(r=0.58,P0.01)呈正相關(guān)關(guān)系,與CD4+T細胞(r=-0.24,P0.01)和CD8+T細胞(r=-0.26,P0.01)呈負相關(guān)關(guān)系;M-MDSCs與HCV RNA載量、ALT、AST、CD4+T細胞和CD8+T細胞均無相關(guān)關(guān)系(P0.05)。4 ROC分析顯示G-MDSCs對SVR的預(yù)測價值最大,其最佳診斷界值為5.38%;5單因素和多因素Logistic回歸分析顯示HCV基因型(CI.95%:3.75-12.33;P0.01)、外周血G-MDSCs水平(CI.95%:1.62-5.47;P=0.01)和RVR(CI.95%:1.34-8.48;P=0.03)是CHC患者抗病毒治療獲得SVR的獨立預(yù)測因素。第二部分慢性丙型肝炎患者MDSCs對T細胞功能及表型的影響1 HCV核心蛋白可誘導(dǎo)PBMCs細胞表型向G-MDSCs(HLA-DR-/lowCD33+CD11b+CD14-)轉(zhuǎn)化而不是M-MDSCs(HLA-DR-/lowCD33+CD11b+CD14+),PEG-IFN/RBV通過降低HCV RNA減少G-MDSCs含量;2 G-MDSCs能通過細胞-細胞接觸方式顯著抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞增殖、IFN-γ分泌,Non-SVR患者G-MDSC抑制T細胞增殖的能力明顯強于SVR患者(P0.05),而兩組人群M-MDSC對T細胞增殖抑制能力差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);3 G-MDSC可以促進T細胞凋亡(P0.05),而M-MDSC則不會(P0.05),Non-SVR患者G-MDSC促進T細胞凋亡的能力顯著高于SVR患者(P0.05);4 G-MDSC能夠顯著降低S期和G2期CD4+T細胞和CD8+T細胞而增加G0-G1期T細胞比例(P0.05);5 G-MDSC與中心記憶性CD4+T細胞(r=-0.46,P0.01)和中心記憶性CD8+T細胞(r=-0.28,P=0.02)呈負相關(guān)關(guān);M-MDSC與各記憶性T細胞亞群均無統(tǒng)計學相關(guān)性(P0.05);6 CHC患者G-MDSCs與Treg細胞呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.42,P0.05),并可誘導(dǎo)Treg細胞生成(P0.05);M-MDSCs與Treg細胞無線性相關(guān)關(guān)系(r=0.23,P=0.08),不能誘導(dǎo)Treg細胞增長(P0.05);7 CHC患者MDSCs誘導(dǎo)T細胞表型的改變,上調(diào)T細胞表達PD-1(P0.05)、CTLA-4和Tim-3(P0.05),下調(diào)OX40表達(P0.05)。第三部分慢性丙型肝炎患者MDSCs抑制T細胞機制研究1 Non-SVR患者血清中Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β、IL-6、IL-10表達高于健康人和SVR患者,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);2 Non-SVR患者G-MDSC的Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β、IL-6和IL-10基因表達高于健康人和SVR患者,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);3 Non-SVR患者G-MDSCs中STAT3及p-STAT3表達高于健康人和SVR患者,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而M-MDSC中STAT3及p-STAT3表達在三組人群中差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);4 CHC患者使用S31-201阻斷MDSC的STAT3,STAT3、p-STAT3以及Arg-1水平均有顯著下降(P0.05);5相對于未阻斷STAT3的G-MDSC,阻斷STAT3后,G-MDSC對CD4+T細胞和CD8+T細胞增殖和IFN-γ分泌抑制功能顯著下降(P0.05);6 IL-10刺激能顯著增加G-MDSC的Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β和IL-6表達(P0.05);S31-201阻斷STAT3可以抑制IL-10活化STAT3引起的Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β和IL-6表達增加(P0.05);7 IL-10能夠促進G-MDSC的STAT3和p-STAT3活化(P0.05),不能促進M-MDSC的STAT3和p-STAT3活化(P0.05);S31-201能夠降低MDSC的STAT3和p-STAT3活化(P0.05);8 IL-10能夠促進G-MDSC的Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β和IL-6 m RNA基因表達(P0.05),S31-201能夠阻斷IL-10的這一作用。結(jié)論 1 G-MDSCs與HCV RNA載量、ALT、AST、LSM呈正相關(guān)關(guān)系,與CD4+T細胞和CD8+T細胞呈負相關(guān)關(guān)系,是CHC患者抗病毒治療獲得SVR的獨立預(yù)測因素;2 HCV核心蛋白可促進G-MDSCs而不是M-MDSCs增加,PEG-IFN/RBV通過抑制HCV復(fù)制顯著降低G-MDSCs;3 G-MDSCs能顯著抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖、IFN-γ分泌,促進T細胞凋亡,誘導(dǎo)中心記憶性CD4+T細胞和CD8+T細胞分化、Treg細胞擴增,上調(diào)T細胞表面PD-1、CTLA-4和Tim-3表達;4 IL-10能夠通過激活MDSC的STAT3通路,增加Arg-1、COX-2、i NOS、TGF-β和IL-6表達,增強G-MDSCs對CD4+T細胞和CD8+T細胞的免疫抑制功能。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：R512.63
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
中英文對照表
引言
第一部分 影響慢性丙型肝炎患者抗病毒治療預(yù)后因素研究
    前言
    材料與方法
        1 材料
        2 方法
        3 研究內(nèi)容
    統(tǒng)計分析方法
    技術(shù)路線圖
    結(jié)果
        1 慢性丙型肝炎患者與健康對照一般情況及可比性分析
        2. CHC患者干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療療效
        3. CHC患者中獲得SVR者與未獲得SVR者臨床病理參數(shù)比較
        4. 外周血MDSCs對SVR的預(yù)測界值分析
        5. 外周血MDSCs細胞含量與臨床病理指標的關(guān)系
        6. 影響CHC患者抗病毒治療持久病毒學應(yīng)答的因素分析
    討論
    小結(jié)
第二部分 慢性丙型肝炎患者 MDSCs 對 T 細胞功能及表型的影響
    前言
    材料與方法
        1 研究材料
        2 研究方法
    研究內(nèi)容
    統(tǒng)計分析方法
    技術(shù)路線圖
    結(jié)果
        1 HCV核心蛋白誘導(dǎo)MDSCs的產(chǎn)生
        2. CHC患者MDSCs對T細胞增殖的抑制
        3. CHC患者MDSCs對T細胞功能的抑制
        4. CHC患者MDSCs誘導(dǎo)T細胞凋亡
        5. CHC患者MDSCs對T細胞細胞周期的影響
        6. CHC患者MDSCs對T細胞亞群的影響
        7 CHC患者MDSCs誘導(dǎo)T細胞表型的改變
    討論
    小結(jié)
第三部分 慢性丙型肝炎患者 MDSCs 抑制 T 細胞機制研究
    前言
    材料與方法
        1 研究材料
        2 研究方法
        3 研究內(nèi)容
    統(tǒng)計分析方法
    技術(shù)路線圖
    結(jié)果
        1 三組人群血清炎癥因子ELISA檢測
        2 三組人群PBMCs中的MDSCs抑制性基因檢測
        3 不同人群MDSCs細胞STAT3 表達比較
        4. 抑制劑阻斷STAT3 通路抑制MDSCs產(chǎn)生Arg-1
        5. STAT3 通路抑制劑對MDSCs抑制T細胞能力的影響
        6. IL-10 對STAT3 的激活作用
    討論
    小結(jié)
結(jié)論
研究創(chuàng)新與不足
    1 研究創(chuàng)新
    2 研究不足
參考文獻
綜述
    參考文獻
附表
圖表目錄
攻讀博士期間發(fā)表的論文及參與的項目
致謝

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本文編號：2876873