重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是一種病因復雜,發(fā)病機制不明,臨床常見的急腹癥,其病情兇險,預后不良,治療棘手,并發(fā)癥多,目前病死率仍高達20-30%,有關(guān)其治療方法的探索一直是研究的熱點。 目前臨床上已有通過檢測C反應蛋白和降鈣素原等來判斷SAP炎預后,但是應用價值非常有限。SAP的一個重要問題是尚沒有一個特異的血清學或者其他指標來診斷和預測預后,進而指導治療。 髓樣細胞表達的激發(fā)受體(triggering receptor expressed on myeloid cells,TREM)屬免疫球蛋白超家族。TREM-1首次發(fā)現(xiàn)是在2001年,加深了人們對炎癥反應啟動和發(fā)展過程的認識。其主要表達于中性粒細胞、成熟單核細胞和巨噬細胞等天然免疫反應的效應細胞,選擇性地表達于肺泡、腸液及其他體液的吞噬細胞上。TREM-1在眾多炎癥反應參與的疾病(包括感染性和非感染性炎癥反應、腫瘤等)中均有表達。TREM-1能促進小鼠促炎因子分泌,誘導中性粒細胞和單核細胞分泌中性粒細胞趨化因子,如IL-8、單核細胞趨化蛋白(MCP-1、MCP-3)及巨噬細胞炎癥反應蛋白-1α(MIP-1α)。TREM-1的激活能導致中性粒細胞迅速脫顆粒、呼吸爆發(fā)及吞噬作用。Toll樣受體(TLR)-2或TLR-4與配體識別后可激活TREM-1,促進大量致炎細胞因子的釋放,同時抑制IL-10的釋放。TREM-1與這些下游細胞因子形成一個正反饋的自分泌調(diào)節(jié)回路,促使炎癥反應增強放大。同時,通過磷脂酰肌醇-3激酶依賴途徑,激活TLRs可促進TREM-1的表達。TLR可能通過激活NF-κB,來調(diào)節(jié)TREM-1的表達；而TREM-1同樣可以激活多種轉(zhuǎn)錄復合物,協(xié)同NF-κB促進促炎因子基因的轉(zhuǎn)錄。這些研究結(jié)論顯示,TREM-1和TLR共同介導炎癥反應。TREM-1介導的信號轉(zhuǎn)導通路在炎癥反應的級聯(lián)放大和膿毒癥的發(fā)生中起著關(guān)鍵性的作用。Gibot等人分別構(gòu)建了小鼠膿毒癥模型和Wistar大鼠膿毒癥模型,分別合成了類似小鼠和大鼠TREM-1胞外區(qū)部分合成肽段,在小鼠膿毒性休克模型里,小鼠胞外區(qū)合成肽可以保護內(nèi)毒素血癥小鼠免于死亡,而在大鼠模型中,利用合成大鼠胞外區(qū)肽段治療,發(fā)現(xiàn)可以改善血流動力學狀態(tài),減輕乳酸酸中毒癥狀,調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1β等促炎因子的釋放,提高生存率。研究結(jié)果顯示,胞外區(qū)肽段可能成為膿毒癥治療的有效靶標。 本課題擬通過小鼠SAP模型,分析TREM-1 mRNA水平的表達以及使用免疫組化的方法檢測TREM-1蛋白水平的表達,評估其在SAP病程中的作用；構(gòu)建小鼠TREM-1-IgG融合蛋白的原核表達載體,在大腸桿菌中大量表達并純化出小鼠TREM-1融合蛋白,對其進行優(yōu)化,取得較高純度蛋白,用于治療小鼠SAP,驗證TREM-1作為SAP分子治療靶點的價值,從而為更深入了解TREM-1的信號轉(zhuǎn)導機制,為明確TREM-1能否作為各種疾病的診斷標志和治療靶點提供依據(jù),為探索相關(guān)疾病新的治療方法提供線索。 一、TREM-1在小鼠SAP的表達 目的：檢測小鼠SAP胰腺組織TREM-1的表達 方法：50只雄性昆明小鼠隨機分為5組,用生理鹽水配置20%L-精氨酸利用腹腔注射的方法,按照4g／kg的劑量,間隔一小時重復注射一次,制備SAP模型。對照組昆明小鼠,腹腔注射生理鹽水,造模后24h,48h,72h,96h分批處死小鼠,心臟采血,同時留取胰腺,肝臟,肺臟組織。測定淀粉酶,肌酐和谷丙轉(zhuǎn)氨酶,觀察各組小鼠胰腺等組織病理學變化并評分；并以RT-PCR, real-timePCR的方法檢測外周血白細胞及胰腺組織TREM-1 mRNA表達；免疫組化法檢測小鼠胰腺組織中TREM-1蛋白表達。 結(jié)果：血清淀粉酶檢測和組織病理學結(jié)果,證實造模成功。各組小鼠按照時間點處置,無菌操作下留取胰腺組織,抽提總mRNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增出小鼠TREM-1,擴增產(chǎn)物與預期目的基因一致,回收純化產(chǎn)物送檢測序,測序結(jié)果與GenBank公布的序列同源性100%。進行real-timePCR相對定量檢測,統(tǒng)計結(jié)果顯示TREM-1 mRNA表達量隨著病程進展在各組小鼠胰腺組織中發(fā)生變化。免疫組化結(jié)果顯示TREM-1蛋白在SAP小鼠的胰腺組織存在表達。 結(jié)論：TREM-1的相對表達量在SAP小鼠病程中逐漸升高,48h升至頂峰,后逐漸下降,提示TREM-1在SAP的發(fā)生發(fā)展中有一定作用。 二、TREM-1-IgG重組融合蛋白原核表達載體的構(gòu)建、表達、純化和鑒定 目的：構(gòu)建小鼠TREM-1-IgG重組融合蛋白的原核表達載體,大量表達融合蛋白,純化后進行鑒定。 方法：利用限制性內(nèi)切酶位點EcoR I, BamH I和Xho I,雙酶切表達載體pMD18-T; pMD18-T/小鼠TREM-1胞外區(qū)質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/BamHI雙酶切；pMD18-T/人IgG-Fc質(zhì)粒經(jīng)BamH I/Xho I雙酶切；酶切后的三片段由T4DNA ligase連接,連接產(chǎn)物應用CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細胞,抽提鑒定重組質(zhì)粒pGEX4T-1/小鼠TREM1-IgG。選擇自構(gòu)建載體pet-28a-His-sumo為表達載體,從pGEX4T-1/小鼠TREM-1-IgG質(zhì)粒上PCR擴增目的片段,BglⅡ/XhoⅠ雙酶切后的片段接入到pet28a-His-sumo,構(gòu)建表達重組蛋白的原核表達質(zhì)粒pet28a/小鼠TREM-1-IgG。經(jīng)測序鑒定無誤。陽性克隆轉(zhuǎn)入BL21以后,IPTG誘導表達蛋白,同時優(yōu)化表達條件,使用His-affinity-resin層析柱純化；初步純化后的融合蛋白為小鼠TREM-1-IgG(含載體上SUMO蛋白),應用SUMO蛋白酶酶切去除SUMO。純化后的蛋白進行SDS-PAGE及Western-Blot來鑒定表達產(chǎn)物。 結(jié)果：重組質(zhì)粒pGEX4T-1/小鼠TREM1-IgG原核表達載體構(gòu)建后,經(jīng)轉(zhuǎn)化入E.coli DH5a后質(zhì)粒進行雙酶切,RT-PCR擴增后行酶切,獲得原質(zhì)粒和目的基因的兩條特異性條帶,并經(jīng)測序鑒定。SDS-PAG及Western-Blot分析證實表達產(chǎn)物為TREM-1融合蛋白。更換載體進行蛋白優(yōu)化,使用SUMO蛋白酶將初步純化后的表達產(chǎn)物去除SUMO,獲得純化后TREM-1融合蛋白,行SDS-PAGE和Western Blot檢測,證實為目的蛋白。 結(jié)論：成功構(gòu)建了小鼠TREM-1重組融合蛋白的原核表達載體,對表達產(chǎn)物進行蛋白優(yōu)化過程,通過SAS-PAGE和Western-Blot檢測,證實為目的蛋白。 三、TREM-1融合蛋白對SAP小鼠的治療作用 目的：觀察TREM-1融合蛋白對SAP小鼠的治療作用 方法：70只昆明種小鼠,每只經(jīng)腹腔注射精氨酸構(gòu)建SAP模型后,隨機將其分為7組,一組和二組為TREM-1融合蛋白治療組,造模后6小時經(jīng)尾靜脈注射TREM-1融合蛋白,給藥濃度為8mg/kg,三組和四組為陽性對照組,七組為陰性對照組。采用目前臨床上治療SAP的藥物烏司他丁,給藥濃度為10萬U／kg,五組和六組為SAP對照組,以生理鹽水靜脈注射。一、三、五組分別在造模后24h處死,二、四、六組分別在造模后72h處死。檢測外周血中炎癥因子的表達,病理分析胰腺和肺臟的損傷情況,評估TREM-1重組融合蛋白的治療作用。同時免疫組化半定量觀察療效。 結(jié)果：TREM-1融合蛋白治療組可顯著提高生存率(P0.05)；病理學結(jié)果示TREM-1融合蛋白治療組較SAP對照組在胰腺及肺臟的水腫出血,炎癥,壞死明顯減輕(P0.05)；血清中炎癥因子(sTREM-1, MIP-1α和超敏CRP)含量顯著低于SAP對照組(P0.05)；免疫組化結(jié)果證實TREM-1融合蛋白24h治療組的胰腺及肺臟組織中NF-KB陽性率及染色強度較SAP對照組顯著降低(P0.05)；與烏司他丁治療組療效相當(P0.05)。 結(jié)論：TREM-1重組融合蛋白能有效緩解SAP小鼠的炎癥反應,減輕胰腺、肺臟組織損害,降低血清中炎性因子含量。 通過上述研究,本課題得出以下結(jié)論： 1、TREM-1參與了SAP發(fā)生發(fā)展過程中的炎癥反應,外周血TREM-1含量在SAP小鼠病程中逐漸升高,48h升至頂峰,后逐漸下降。 2、成功構(gòu)建了小鼠TREM-1融合蛋白的原核表達載體,大量表達并純化出小鼠TREM-1重組融合蛋白；并經(jīng)鑒定證實為目的蛋白。 3、TREM-1融合蛋白能有效緩解SAP小鼠的炎癥反應,減輕胰腺、肺臟組織損害,提高生存率,動物實驗初步證實TREM-1作為分子治療靶點可能是SAP治療的一個新選擇。 小結(jié)：本研究通過動物模型初步證實TREM-1在SAP小鼠中表達,同時構(gòu)建載體,表達并純化獲得小鼠TREM-1重組融合蛋白,觀察TREM-1重組融合蛋白對SAP小鼠的治療作用,通過ELISA方法檢測血清中TREM-1,CRP, IL-1β,MIP-1α等炎癥因子,以及組織病理變化來觀察療效,了解TREM-1與各種炎癥因子的相互作用,初步證實了TREM-1作為小鼠SAP分子治療靶點的價值。為SAP患者外周血sTREM-1含量檢測在臨床的應用和后續(xù)尋找鑒定TREM-1的天然配體奠定了基礎(chǔ)。為SAP發(fā)病機制的探討和分子靶向治療提供新的思路。
【學位單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R576
【部分圖文】：

血清谷內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶的檢測結(jié)果

4h胰腺(xzoos

第二軍醫(yī)大學碩士學位論文大量中性粒細胞。48h、72h、96h出血明顯，肺泡間質(zhì)明顯增寬，大部分肺泡和間質(zhì)有中性粒細胞浸潤，結(jié)構(gòu)損害較重。(圖1一12)顯微鏡下觀察肝臟:出血、炎癥、壞死不明顯，各組之間無明顯差別。圖(l一13)對各組病理變化按照方法中的評分標準進行病理評分，利用SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，各組胰腺組織隨著病程進展，炎癥壞死加重(P<0.05)。
【引證文獻】

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 凌穎;SAP合并急性肺損傷的機制及地塞米松的防治作用研究[D];川北醫(yī)學院;2012年

本文編號：2871916