內(nèi)臟痛是許多胃腸道疾病最常見的癥狀之一,但其發(fā)生機(jī)制還不清楚。目前認(rèn)為,內(nèi)臟異常疼痛的產(chǎn)生主要?dú)w結(jié)為外周敏感化和中樞敏感化。各種原因引起的內(nèi)臟組織和初級傳入神經(jīng)元的敏感化可以誘導(dǎo)和易化中樞敏感化,所以了解初級神經(jīng)元敏感化的機(jī)制,探索降低其興奮性的方法對干預(yù)痛覺信號的傳導(dǎo)、控制疼痛具有重要意義。 內(nèi)臟感覺主要通過結(jié)狀神經(jīng)節(jié)與脊髓背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)傳入到次級感覺神經(jīng)元,其中一般的內(nèi)臟感覺主要通過結(jié)狀神經(jīng)節(jié)傳導(dǎo),而痛覺主要通過DRG神經(jīng)元傳導(dǎo)。按其直徑不同,DRG神經(jīng)元可以分為大型神經(jīng)元(39-50μm)、中型神經(jīng)元(33-38μm)和小型神經(jīng)元(19-27μm)三類。其中,中、小型神經(jīng)元主要發(fā)出細(xì)髓的Aδ纖維和無髓的C類纖維,傳遞傷害性感覺,與痛覺產(chǎn)生密切相關(guān)。因此,DRG中的中小神經(jīng)元是內(nèi)臟痛覺信號傳導(dǎo)與調(diào)控的初級靶點(diǎn)。 電壓依賴性鈉通道決定神經(jīng)細(xì)胞動作電位的產(chǎn)生和傳導(dǎo),它的改變對于神經(jīng)元的興奮性具有重要的影響。鈉通道由一個α亞單位和兩個β亞單位組成。目前已經(jīng)克隆出九種α亞單位,并據(jù)此將電壓依賴性鈉通道分為9種類型,即Nav1.1-Nav1.9。根據(jù)其對河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)的敏感性又可分為河豚毒素敏感(TTX-sensitive,TTX-S)和河豚毒素不敏感(TTX-resistant,TTX-R)兩種類型。其中,Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.6和Nav1.7屬于TTX-S鈉通道,而Nav1.5,Nav1.8和Nav1.9屬于TTX-R鈉通道。Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9參與痛覺信號的調(diào)控。一些誘發(fā)疼痛的病理性因素影響DRG細(xì)胞中鈉通道的表達(dá)和功能,改變DRG細(xì)胞的興奮性。 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子,廣泛存在于中樞與外周神經(jīng)系統(tǒng)中。以往的研究認(rèn)為,BDNF的主要作用是調(diào)節(jié)突觸的可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,參與學(xué)習(xí)和記憶過程。但近來越來越多研究發(fā)現(xiàn),BDNF也參與對痛覺傳導(dǎo)的調(diào)控。在脊髓中,BDNF由DRG細(xì)胞合成后被運(yùn)輸?shù)街袠卸?在脊髓后角釋放,與第二級感覺神經(jīng)元上的Trk B受體結(jié)合,調(diào)節(jié)突觸傳遞和脊髓痛覺的傳導(dǎo),導(dǎo)致中樞神經(jīng)元興奮性的改變。BDNF還可以通過自分泌和旁分泌的方式調(diào)節(jié)DRG神經(jīng)元的興奮性。 腸道益生菌是與人類共生的、具有治療或保健作用的細(xì)菌,主要包括乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri)和雙歧桿菌。它們能夠調(diào)節(jié)炎癥引起的腸道敏感性的改變,調(diào)節(jié)腸道內(nèi)在感覺神經(jīng)元的興奮性,對一些腸道疾病包括腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)和炎癥性腸道疾病等所引起的腹部不適癥狀具有明顯的改善作用。 由于重復(fù)的結(jié)直腸擴(kuò)張刺激(colorectal distention,CRD)能夠誘導(dǎo)內(nèi)臟高敏感性,本課題研究該模型大鼠DRG神經(jīng)元興奮性的改變及其機(jī)制,探討鈉通道和BDNF在DRG興奮性改變中所起的作用,并進(jìn)一步研究乳酸桿菌對DRG興奮性改變的調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)機(jī)制。本課題將揭示DRG神經(jīng)元興奮性的改變在內(nèi)臟高敏感性發(fā)生中的作用,并為尋找新的鎮(zhèn)痛藥物提供依據(jù)。 [研究目的] 1探討CRD對大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸DRG神經(jīng)元興奮性的影響。 2探討CRD后大鼠DRG神經(jīng)元電壓依賴性鈉通道表達(dá)和功能是否發(fā)生改變。 3研究CRD對大鼠DRG神經(jīng)元BDNF表達(dá)的影響及外源性BDNF在CRD致大鼠DRG神經(jīng)元敏感化過程中所起的作用。 4探討乳酸桿菌對CRD后大鼠DRG神經(jīng)元敏感性的影響及其機(jī)制。 [研究方法和結(jié)果] 1結(jié)直腸擴(kuò)張內(nèi)臟痛模型的建立 1.1 DRG神經(jīng)元的逆行標(biāo)記 健康雄性SD大鼠,腹腔注射麻醉,打開腹腔,找到結(jié)腸遠(yuǎn)端,向結(jié)腸壁注射1,1-dioctadecyl-3-3-3-3-tetramethylindocarbocyanine(DiI,5mg/ml),注射6到10個點(diǎn)(1.0μl/injection),縫合腹壁。 1.2 CRD內(nèi)臟痛模型的建立 注射DiI兩周后,大鼠腹腔內(nèi)注射氯胺酮(75mg/kg)與甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉,利用Barostat system(Distender,G J Electronic Inc)給予1小時重復(fù)的CRD刺激(80 mm Hg,30s on,30 s off),對照組只給予氯胺酮與甲苯噻嗪腹腔注射麻醉,不給予CRD刺激。 2擴(kuò)張腸段MPO活性檢測 大鼠處死后,取擴(kuò)張的遠(yuǎn)端結(jié)腸段,根據(jù)試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書檢測單位結(jié)腸重量中MPO的活性。結(jié)果顯示,同no CRD組相比,在分別給予CRD后1h、3h、6h、12h、24h,其MPO活性未見明顯增加。 3 RT-PCR檢測CRD后不同時間段DRG中BDNF mRNA含量的表達(dá) 提取DRG中mRNA,檢測發(fā)現(xiàn)在CRD后3h、6h、12h、24h,DRG中的BDNF mRNA含量明顯增高。 4 ELISA檢測CRD后不同時間段DRG中BDNF蛋白含量的變化 提取DRG中蛋白,檢測發(fā)現(xiàn)同正常DRG相比,CRD后1h、3h、6h、12h、24h,DRG中BDNF蛋白含量明顯增高。 5 DRG細(xì)胞的培養(yǎng) 給予CRD刺激之后,立刻頸椎脫臼犧牲大鼠,取出腰骶段脊柱,取出兩邊的DRG;置于Krebs溶液中;加入膠原酶Ⅰ(1mg/ml)和胰酶(0.25%),37℃消化50min,接種于包被了PLL的35mm培養(yǎng)皿中,37℃,5%CO_2,95%O_2培養(yǎng)過夜。 6膜片鉗記錄 6.1 CRD細(xì)胞自發(fā)放電 在電流鉗模式下,I=0,記錄細(xì)胞自發(fā)放電的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),no CRD組,自發(fā)放電的細(xì)胞占7.3%;CRD組自發(fā)放電細(xì)胞數(shù)量有所增加占9.4%,兩者未見顯著性差異。 6.2 CRD刺激之后動作電位的產(chǎn)生和各項(xiàng)指標(biāo)的檢測 記錄刺激動作電位產(chǎn)生所需要的基強(qiáng)度和2倍、3倍基強(qiáng)度刺激產(chǎn)生動作電位的數(shù)量。結(jié)果顯示,在給予1h重復(fù)CRD刺激后,DRG神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位基強(qiáng)度降低,2倍、3倍基強(qiáng)度刺激誘發(fā)DRG神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位的數(shù)量增多,說明CRD后DRG神經(jīng)元的興奮性明顯增高。 6.3 CRD對大鼠DRG神經(jīng)元鈉電流的影響 電極電阻控制在2-4 MΩ,所有的鈉電流在細(xì)胞成為全細(xì)胞之后5分鐘進(jìn)行記錄,串聯(lián)電阻被補(bǔ)償85-90%。分別記錄no CRD組和CRD組大鼠DRG細(xì)胞鈉通道的激活、失活及復(fù)活電流的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在CRD后,大鼠DRG細(xì)胞上TTX-S和slow TTX-R鈉通道的激活和復(fù)活過程沒有發(fā)生明顯的改變,而其失活曲線向去極化方向移動,表明其失活電壓依賴性發(fā)生改變。 6.4 BDNF對正常及CRD大鼠DRG神經(jīng)元興奮性的影響 研究發(fā)現(xiàn),no CRD組在加入5ng/ml BDNF 5min后,DRG動作電位閾值及動作電位的產(chǎn)生頻率都未見變化,而幅值、去極化的速率明顯下降;在CRD組中神經(jīng)元加入同樣劑量的BDNF后,DRG神經(jīng)元動作電位的閾值明顯升高,給予3倍基強(qiáng)度刺激誘發(fā)DRG神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位的數(shù)量減少。說明BDNF下調(diào)CRD后DRG神經(jīng)元的敏感性。 6.5乳酸桿菌對正常及CRD大鼠DRG神經(jīng)元敏感性的影響。 用乳酸桿菌(5×10~9CFU/ml)連續(xù)灌胃對正常大鼠DRG神經(jīng)元的電生理特性沒有影響,但明顯升高CRD后DRG神經(jīng)元動作電位產(chǎn)生的基強(qiáng)度,降低動作電位的去極化速率及產(chǎn)生頻率,說明乳酸桿菌下調(diào)CRD后DRG神經(jīng)元的興奮性。 [結(jié)論] 1遠(yuǎn)端結(jié)腸受到80mmHg的CRD刺激1h后,可以引起相應(yīng)節(jié)段DRG細(xì)胞興奮性明顯增加。 2 CRD后DRG神經(jīng)元電壓依賴性鈉通道失活動力學(xué)發(fā)生改變,這可能是CRD導(dǎo)致DRG細(xì)胞高敏感性的發(fā)生的原因之一。 3內(nèi)源性BDNF可能下調(diào)CRD后DRG神經(jīng)元的興奮性。 4乳酸桿菌抑制CRD引起的DRG神經(jīng)元的敏感化,對內(nèi)臟痛具有潛在的治療作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R57
【部分圖文】：

1.1DII標(biāo)記的DRG神經(jīng)元，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)桔紅色熒:倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài):圖A中細(xì)胞所發(fā)出的熒光:倒置顯微鏡下，圖A中箭頭所指的細(xì)胞的形態(tài):圖C中細(xì)胞所發(fā)出的熒光igure1.1DII一labeledneurons，TheisolatedDRGneuronthateulturedovernight.，AftertemPeraryUVillumination，eellsinfig.Aemitsorange一redfluoreseenee.，Theshapeoftheneuroninfig.Amarkedbyarrow.，AftertemPeraryUVillumination，thecellinfig.Cemitsorange一redfluoreseenee，

圖1.2:遠(yuǎn)端結(jié)腸中MPO活性Figurel.2TheMPOaetivityindistaleolonRG細(xì)胞數(shù)量的變化RD刺激組大鼠的DRG神經(jīng)元都可以見到少量的自發(fā)放細(xì)胞，其中有6個自發(fā)放電(7.3%);CRD組記錄64個電(9.4%)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，二者未見顯著性差異。DR圖1.3。DRG中感覺神經(jīng)元的靜息電位為一54.53士1.01mV;CR2mV，兩者未見顯著性差異(圖1.4)。

對照組記錄82個細(xì)胞，其中有6個自發(fā)放電(7.3%);CRD組記錄64個細(xì)胞，其中有6個自發(fā)放電(9.4%)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，二者未見顯著性差異。DRG中神經(jīng)元典型自發(fā)放電見圖1.3。對照組大鼠DRG中感覺神經(jīng)元的靜息電位為一54.53士 1.01mV;CRD組靜息電位為一53.巧士1.22mV，兩者未見顯著性差異(圖1.4)。
【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 姜彬言;王巧民;;益生菌治療腸易激綜合征的相關(guān)機(jī)制[J];醫(yī)學(xué)綜述;2011年15期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 姜彬言;益生菌治療對IBS患者腸道菌群、心理狀況、生活質(zhì)量及癥狀的影響[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2012年

本文編號：2867160