目的 丙型肝炎病毒(HCV)在人體內(nèi)以準(zhǔn)種的形式存在。HCV準(zhǔn)種感染是導(dǎo)致丙型肝炎慢性化和影響干擾素療效的重要原因之一。本研究分別對(duì)應(yīng)用干擾素治療的慢性丙型肝炎患者HCV基因組中高變區(qū)1(HVR1)和非結(jié)構(gòu)區(qū)5A(NS5A)進(jìn)行了準(zhǔn)種檢測(cè)，以探討HCV準(zhǔn)種感染與干擾素療效之間的關(guān)系，是否可以對(duì)干擾素治療進(jìn)行療效預(yù)測(cè)，以及HCV準(zhǔn)種異質(zhì)性與HCV RNA含量之間的相互關(guān)系，為臨床選擇應(yīng)用干擾素抗病毒治療適應(yīng)癥及預(yù)測(cè)療效提供理論依據(jù)。 材料與方法 研究對(duì)象：應(yīng)用干擾素治療的HCV RNA陽性的慢性丙型肝炎患者共20例，男15例，女5例。年齡23-45歲。干擾素治療方案：α-干擾素3MU，3次／周肌肉注射，共24周。療效判定：治療結(jié)束時(shí)，ALT正常、HCV RNA陰轉(zhuǎn)為暫時(shí)應(yīng)答；ALT正常、HCV RNA陰轉(zhuǎn)持續(xù)至治療結(jié)束6個(gè)月以上為持續(xù)應(yīng)答，否則為無應(yīng)答。留取治療前血清，-70℃凍存?zhèn)溆谩?HCV HVR1及NS5A基因片斷擴(kuò)增：采用巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)。分別在HVR1及NS5A兩側(cè)保守區(qū)設(shè)計(jì)PCR引物。首先應(yīng)用常規(guī)的HCV RNA提取方法—異硫氰酸胍-酚-氯仿提取法從血清中提取HCV RNA，然后經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄及兩輪PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出HVR1及NS5A區(qū)基因片斷。 HCV基因分型：分別采用型特異性PCR法及核苷酸序列測(cè)定法。型特異性PCR法為在C區(qū)設(shè)計(jì)公共的上游引物及4條型特異性下游引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，依據(jù)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果直接區(qū)分HCV四種基因型。核苷酸序列測(cè)定法：應(yīng)用直接測(cè)序法對(duì)NS5A區(qū)進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，依此進(jìn)行基因型的劃分。 HVR1區(qū)準(zhǔn)種異質(zhì)性檢測(cè)：采用克隆測(cè)序法。HVR1區(qū)PCR陽性產(chǎn)物純化后，與載體質(zhì)粒進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，通過培養(yǎng)選擇陽性菌落，每份標(biāo)本挑取10個(gè)陽性克隆，進(jìn)行重組質(zhì)粒提取，經(jīng)PCR驗(yàn) 證后進(jìn)行核昔酸序列測(cè)定。 NSSA區(qū)準(zhǔn)種檢測(cè)：采用直接測(cè)序法。NSSA區(qū) PCR陽性產(chǎn)物純化后， 直接進(jìn)行核谷酸序列測(cè)定。 HCV RNA定量檢測(cè)：應(yīng)用特異性熒光探針PCR法。采用PCR方法結(jié) 合熒光探針的擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，通過檢測(cè)PCR反應(yīng)體系中熒光強(qiáng)度的變化， 并根據(jù)純化HCV RNA建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可推算出樣本中 HCV RNA含量。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1．HVRI及 NSSA基因片斷的擴(kuò)增 經(jīng)RT－PCR擴(kuò)增的HCV HVRI及NSSA 基因片斷大小分別為388hP 和573hp，電泳結(jié)果見圖1。 2．HCV基因分型 20例患者應(yīng)用型特異性PCR法分型結(jié)果為：DO）型14例（7％X 皿p叫型4例＊0％XJ和皿混合型2例O％八電泳結(jié)果見圖2。對(duì)上 述患者中 12例 11型患者應(yīng)用直接測(cè)序法進(jìn)行了分型，結(jié)果 12例 11型患者 中除1例為k型外，其余均為幾型（見圖3人兩種檢測(cè)方法一致性為 gi．7阮。 3．HVRI準(zhǔn)種異質(zhì)性與干擾素療效的關(guān)系 對(duì)7例幾型患者進(jìn)行了克隆測(cè)序，其中3例為持續(xù)應(yīng)答者／例為無 應(yīng)答者。每份血清挑取10個(gè)陽性克隆，共獲得了63個(gè)克隆的序列，氨基酸 序列結(jié)果見圖4。HVRI準(zhǔn)種的復(fù)雜性（準(zhǔn)種數(shù)）在無應(yīng)答組明顯高于持續(xù) 應(yīng)答組＊＝6．737，P＜0．ofL見表 1。HVRI準(zhǔn)種基因的差異性（nucleohde diversity）以每個(gè)基因位點(diǎn)的平均變異率來表示。無應(yīng)答組平均每個(gè)位點(diǎn)的 核昔酸及氨基酸變異率均明顯高于持續(xù)應(yīng)答組，見表2。 4．fo型 HCVNSSA基因變異與干擾素療效的關(guān)系 NS5A2209－2248區(qū)核苛酸序列分析Jl例fo型患者干擾素治療前核昔酸 序列情況見表4。其中3戶號(hào)患者為持續(xù)應(yīng)答者，余為無應(yīng)答者，兩組之間 核耷酸變異數(shù)無顯著差異＊＝0．86，P＞0．05人與 HCV＊相比，變異數(shù) 未超過10％，且多為同義突變，表明NSSA區(qū)高度保守。 NSSA。0。s區(qū)氨基酸序列變異與于擾素療效的關(guān)系：按照Enomoto的 分型方法，11例fo型患者豆例為中間型，余均為野生型，未見突變型。 fZ· NSS A。隊(duì)。區(qū)氨基酸序列變異與于擾素療效無關(guān)。結(jié)果見圖 5。 干擾素治療對(duì) NSS A基因變異的影響：對(duì) 5號(hào)患者的動(dòng)態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，于 擾素治療后NSSA基因發(fā)生了變異，導(dǎo)致其在基因樹中位置改變。（圖3中 5刁j－義5－3X即引起了其準(zhǔn)種的改變，并未導(dǎo)致基因型的變化。核昔 酸變異大多為同義突變。氨基酸變異情況見圖6。 4．HCV準(zhǔn)種復(fù)雜性與HCV RNA含量的關(guān)系 HCV準(zhǔn)種復(fù)雜性與 HCV RNA含量無顯著相關(guān)性卜＝0．432，p＞ 0．05），見表3。 結(jié) 論 1．沈陽地區(qū)慢性丙型肝炎患者以感染 fo型 HCV為主。應(yīng)用型特異 性PCR法與核昔酸序列測(cè)定法所得的結(jié)論基本一致。 2．HCV HVRI區(qū)準(zhǔn)種異質(zhì)性（包括復(fù)雜性與基因的差異性）與干擾素 療效有關(guān)，異質(zhì)性程度越高對(duì)干擾素?zé)o應(yīng)答的可能性越大。 3．HCV NSSA基因片斷具有高度保守性，NSSA＿．＿區(qū)氨基酸變異與 干擾素療效無關(guān)。在中國(guó)丙型肝炎患者中是否存在所謂的干擾素敏感決定 區(qū)門SDR）有待進(jìn)一步探討。 4．HVRI準(zhǔn)種的復(fù)雜性與HCV RNA含量無明顯相關(guān)性，是預(yù)測(cè)干擾 素療效的獨(dú)立因素之一。
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R512.6
【文章目錄】：
一、 中文摘要
二、 英文摘要
三、 英文縮略語
四、 前言
五、 論文一
六、 論文二
七、 論文三
八、 本研究創(chuàng)新點(diǎn)
九、 參考文獻(xiàn)
十、 致謝
十一、 論文綜述
十二、 個(gè)人簡(jiǎn)介
十三、 在學(xué)期間發(fā)表論文

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2864860