背景與目的:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn),其疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關的肝硬化和肝細胞癌。在我國,該病已成為最主要的慢性肝臟疾病之一,約占我國肝臟疾病比例的49.3%。雖然目前已經(jīng)認識到飲食習慣改變、環(huán)境和遺傳因素等共同導致的胰島素抵抗、肥胖和腸道菌群改變等是NAFLD的發(fā)病基礎,但NAFLD特別是NASH的發(fā)病機制仍有待深入闡明。脯氨酰內(nèi)肽酶(PREP)是一種由約700個氨基酸組成的絲氨酸蛋白酶,能特異性水解含不多于30~40個氨基酸的肽鏈中的脯氨酸殘基。有研究表明,PREP與胰島素釋放、攝食行為、器官炎癥性疾病、炎癥細胞因子代謝和肝再生等密切相關。前期體外研究發(fā)現(xiàn)PREP可抑制游離脂肪酸誘導的肝細胞脂肪變,然而,目前尚未見PREP參與NAFLD發(fā)病的體內(nèi)研究報道。為此,本研究采用高脂高膽固醇飲食建立小鼠NAFLD模型,結(jié)合PREP特異性抑制劑KYP-2047,觀察PREP在NAFLD進展中的動態(tài)變化和對疾病發(fā)展的影響。方法:雄性野生型C57BL/6J小鼠分成兩部分實驗。第一部分將小鼠隨機分成對照組和模型組,分別給予高脂高膽固醇飼料和標準飼料飼養(yǎng)4w、8w、12w和16w。第二部分將小鼠隨機分為對照組、模型組和干預組。對照組飼以標準飼料,模型組和干預組持續(xù)飼以高脂高膽固醇飼料,飼養(yǎng)10周后,干預組予以皮下植入膠囊滲透泵持續(xù)穩(wěn)定注射PREP特異性抑制劑KYP-2047,劑量為5mg/kg(體質(zhì)量)/d,對照組和模型組相應注射等量生理鹽水,持續(xù)干預6周。實驗結(jié)束后處死小鼠,收集血清和肝組織等保存待檢測。采用自動生化儀測定血清生化指標;采用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定血清空腹胰島素水平;采用Suc-Gly-Pro-AMC底物法檢測肝組織和血清中PREP活性;采用蘇木素-伊紅染色及Masson染色觀察肝臟病理學改變,并計算NAFLD活動度積分(NAS);采用熒光定量PCR法、Western blot法或免疫組織化學法分別檢測肝組織PREP、基質(zhì)金屬蛋白酶-8/9、胸腺素β4、金屬蛋白酶Meprin-α以及炎癥、脂質(zhì)代謝相關基因和蛋白的表達。結(jié)果:高脂高膽固醇飲食處理滿4w時小鼠可形成輕度脂肪變性,滿8w可達早期NASH,此后NASH呈進行性發(fā)展,滿16w模型組小鼠出現(xiàn)顯著代謝紊亂;肝組織PREP蛋白水平在對照組和模型組之間無統(tǒng)計學差異,但從8w開始模型組血清中PREP活性隨造模時間的延長呈動態(tài)升高,至造模16周,肝內(nèi)和血清中活性均顯著高于對照組(p均0.05)。在造模12w末和16w末,模型組肝組織內(nèi)PREP m RNA、基質(zhì)金屬蛋白酶8/9 m RNA相對表達量和基質(zhì)金屬蛋白酶8/9蛋白水平均顯著高于對照組(p均0.05),而胸腺素β4、Meprin-α蛋白水平均低于對照組(p均0.05)。抑制劑干預研究發(fā)現(xiàn),模型組肝組織內(nèi)炎癥因子及成脂相關基因表達增加,經(jīng)過6周PREP特異性抑制劑KYP-2047干預后,肝組織內(nèi)升高的PREP活性被顯著抑制,干預組小鼠肝臟炎癥和脂肪變明顯減輕,肝酶、胰島素抵抗指數(shù)、炎癥和脂質(zhì)代謝相關因子均顯著改善。結(jié)論:小鼠肝組織PREP活性在NASH階段顯著升高,可能參與小鼠NASH的進展;應用PREP特異性抑制劑能顯著改善高脂飲食誘導的小鼠NASH階段肝臟炎癥和脂肪變,這一作用伴隨肝內(nèi)炎癥因子表達下調(diào)、脂代謝相關因子和胰島素抵抗改善。
【學位單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

高脂飲食 12w 末，模型組小鼠肝臟紅偏黃，體積較腫大，部分被膜不光滑，邊緣較頓，切面明顯油膩感，質(zhì)地欠軟（圖 1G）。高脂飲食 16w 末，模型組小鼠上述改變更加明顯，肝臟色澤偏黃，體積明顯腫大，被膜不光滑，邊緣頓，切面明顯油膩感，質(zhì)地不柔軟（圖 1H）。

肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝血竇清晰，肝細胞大小相似，胞質(zhì)豐富，核圓位于細胞中央（圖2A、2B、2C、2D）。高脂飲食 4w 末，模型組肝組織出現(xiàn)輕度脂肪變性，肝細胞內(nèi)出現(xiàn)少量微小的脂肪空泡，肝索、肝竇較清晰，肝小葉分界清楚，部分可見輕度肝細胞水腫，細胞內(nèi)胞漿豐富，核居中，匯管區(qū)無明顯炎癥細胞浸潤（圖 2E）。高脂飲食 8w 末，模型組肝組織出現(xiàn)輕中度脂肪變性，肝細胞內(nèi)出現(xiàn)中等量大小不等的脂肪空泡，肝索排列紊亂，肝血竇變形狹窄，小葉結(jié)構(gòu)消失，部分可見氣球樣變性（圖 2F）。高脂飲食 12w 末，模型組出現(xiàn)中重度脂肪變性，肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量大小不等的脂肪空泡，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失，肝細胞胞漿疏松，氣球樣變性多見，匯管區(qū)少量炎癥細胞浸潤（圖 2G）。高脂飲食 16w 末，模型組出現(xiàn)重度脂肪變性，肝細胞內(nèi)出現(xiàn)大量大泡性脂肪空泡，肝索排列紊亂，肝血竇消失，肝細胞廣泛氣球樣變性，匯管區(qū)有炎癥細胞浸潤和點狀壞死（圖 2H）。各組小鼠肝臟 NAS 評估結(jié)果見表 9。在 8w、12w 和 16w 末，分別有 5 只、8 只和 10 只小鼠 NAS＞=4 分。

通大學碩士學位論文 Shanghai Jiaotong U組小鼠 PREP 及相關蛋白肝內(nèi)的表達情況。1 各組小鼠肝組織中 PREP mRNA 和蛋白表達情況與對照組相比，模型組肝內(nèi) PREPmRNA 相對表達量伴隨造模時間的延長趨勢，并在造模 12w 和 16w 末，相比于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（p＜ 3A），但蛋白水平在各個周期末，模型組和對照組之間無統(tǒng)計學差異（圖
【參考文獻】

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1 周達;陳源文;范建高;;脯氨酰寡肽酶的肝內(nèi)生物學功能研究進展[J];胃腸病學和肝病學雜志;2015年01期

本文編號：2852777