肝纖維化(Liver fibrosis)主要由病毒感染、酒精中毒等多種因素引起的慢性肝損傷。肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells,HSCs)參與肝纖維化的起始、進(jìn)展和消退過(guò)程,靜止的肝星狀細(xì)胞(Q-HSCs)具有上皮細(xì)胞和脂肪細(xì)胞特征,其向肌成纖維細(xì)胞(MF-HSCs)的轉(zhuǎn)分化是肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié),而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)參與該環(huán)節(jié)。EMT是細(xì)胞失去上皮表型和基因表達(dá)特征,轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程。多數(shù)研究表明,在各器官中肌成纖維細(xì)胞是通過(guò)EMT產(chǎn)生,以應(yīng)對(duì)各種慢性損傷,該過(guò)程在一定條件作用下可發(fā)生逆轉(zhuǎn)。近年研究表明二甲雙胍(metformin,Met)有廣泛的藥理作用,各種藥理機(jī)制中包括抑制EMT過(guò)程。同時(shí)已有實(shí)驗(yàn)證明二甲雙胍可在一定程度緩解肝纖維化,其可以通過(guò)作用HSCs到達(dá)逆轉(zhuǎn)肝纖維化目的。因此,二甲雙胍可能通過(guò)逆轉(zhuǎn)EMT過(guò)程起到抑制肝纖維化的作用,進(jìn)一步對(duì)肝纖維化逆轉(zhuǎn)機(jī)制的認(rèn)識(shí),有望為肝纖維化治療提供新的理論依據(jù)。目的研究二甲雙胍對(duì)小鼠肝纖維化及其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及二甲雙胍是否通過(guò)調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制肝星狀細(xì)胞的活化方法1、將45只4周齡的小鼠隨機(jī)分為3組,每組15只,即正常組、模型組(CCl_4組)、CCl_4+二甲雙胍治療組(CCl_4+Met組);模型組給予橄欖油、CCl_4混合物處理,按1:3比例,經(jīng)腹腔注射,2次/周,劑量為0.4 ml/kg;正常組給予相同容量橄欖油,腹腔注射,2次/周,劑量為0.4 ml/kg;二甲雙胍治療組造模方法同模型組。從第3周開(kāi)始,通過(guò)灌胃給予二甲雙胍治療,200 mg/次,1次/天;正常組和模型組通過(guò)灌胃給予生理鹽水,200 mg/次,1次/天,至造模第6周處死小鼠,取肝臟組織。計(jì)算小鼠的肝臟指數(shù),檢測(cè)肝功能相關(guān)指標(biāo)ALT、AST含量,進(jìn)行HE和天狼猩紅染色觀察小鼠肝臟病理學(xué)改變。通過(guò)Western blot和RT-PCR檢測(cè)肝纖維化相關(guān)蛋白α-平滑肌激動(dòng)蛋白(α-SMA)和Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)含量,EMT相關(guān)蛋白上皮標(biāo)志物如E-cadherin;間質(zhì)標(biāo)記物如vimentin、N-cadherin、Twist的表達(dá)。通過(guò)Image J軟件對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。2、將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞,用0.25%的胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液,接種于12個(gè)培養(yǎng)皿中,平均分為四組即空白對(duì)照組、TGF-β1組、TGF-β1+Met低劑量組、TGF-β1+Met高劑量組�？瞻讓�(duì)照組不做處理;TGF-β1組給予10ng/ml的細(xì)胞因子TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞活化;TGF-β1+Met低劑量組給予10 ng/ml的細(xì)胞因子TGF-β1和5 mmol/ml的二甲雙胍;TGF-β1+Met高劑量組給予10 ng/ml的細(xì)胞因子TGF-β1和10 mmol/ml的二甲雙胍。通過(guò)油紅O染色了解細(xì)胞狀態(tài),通過(guò)免疫熒光、克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活化、增殖、遷移能力,通過(guò)Western blot和RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞活化相關(guān)蛋白α-SMA的表達(dá)和EMT相關(guān)蛋白上皮標(biāo)志物如E-cadherin;間質(zhì)標(biāo)記物如vimentin、N-cadherin及Twist的表達(dá),并通過(guò)Image J軟件對(duì)蛋白表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果1、與正常組比較,CCl_4組肝臟指數(shù)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);與CCl_4組比較,CCl_4+Met組肝臟指數(shù)一定程度降低,但高于正常組,差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。CCl_4組小鼠的肝臟功能相關(guān)指標(biāo)AST、ALT較正常組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);與CCl_4組相比,CCl_4+Met組小鼠AST、ALT含量明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。正常小鼠肝臟組織無(wú)明顯變化;與正常組比較,CCl_4組小鼠匯管區(qū)內(nèi)出現(xiàn)粗大的膠原纖維條索分割包繞,纖維間隔明顯增厚,肝小葉結(jié)構(gòu)明顯異常,有假小葉形成,肝細(xì)胞索排列紊亂,間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯,出現(xiàn)大量膠原沉積,分布廣泛,在匯管區(qū)間分布較多,α-SMA和CollagenⅠ表達(dá)明顯增高;與CCl_4組相比,CCl_4+Met治療組,膠原纖維的增生減輕,假小葉的形成改善,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕,僅有部分膠原增生,肝小葉中可見(jiàn)少量間隔形成,α-SMA和CollagenⅠ表達(dá)減少。WB、RT-PCR結(jié)果顯示:CCl_4組小鼠肝臟內(nèi)α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達(dá)明顯升高;與CCl_4組比較,CCl_4+Met組小鼠肝臟α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達(dá)顯著減少。CCl_4組小鼠肝臟內(nèi)上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)明顯減少,間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、N-cadherin和Twist表達(dá)明顯增多;與CCl_4組比較,CCl_4+Met組小鼠肝臟內(nèi)E-cadherin表達(dá)明顯增加,間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、N-cadherin和Twist表達(dá)明顯減少。2、與空白對(duì)照組比較,TGF-β1組細(xì)胞活化程度、增殖能力明顯升高、遷移能力增加;給予Met干預(yù)后細(xì)胞增殖能力下降、遷移能力下降,有一定程度的濃度依賴(lài)性。WB和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組比較,TGF-β1組α-SMA表達(dá)明顯升高;Met干預(yù)后α-SMA表達(dá)減少,有一定程度的濃度依賴(lài)性。同時(shí),空白對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)上皮標(biāo)志物表達(dá)較多,間質(zhì)標(biāo)志物少量表達(dá);與空白對(duì)照組比較,TGF-β1組上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)明顯減少,間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、N-cadherin和Twist表達(dá)明顯增多;Met干預(yù)后上皮標(biāo)志物表達(dá)增加,間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)減少,有一定程度的濃度依賴(lài)性。結(jié)論(1)腹腔注射CCl_4后,肝功能指標(biāo)升高,肝纖維化相關(guān)α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達(dá)明顯升高,EMT相關(guān)蛋白表達(dá)升高;(2)二甲雙胍可改善肝臟纖維化,使α-SMA和CollagenⅠ的表達(dá)明顯下調(diào);(3)二甲雙胍改善肝纖維化病變程度的同時(shí),抑制肝臟EMT相關(guān)蛋白的表達(dá);(4)TGF-β1誘導(dǎo)HSCs的活化,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá);(5)二甲雙胍可抑制活化HSCs的EMT相關(guān)蛋白表達(dá),且呈濃度依賴(lài)性;(6)在二甲雙胍作用下,HSCs的活化、增殖和遷移能力明顯下降,且呈濃度依賴(lài)性。
【學(xué)位單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：R575.2
【部分圖文】：

第一部分 二甲雙胍對(duì)小鼠肝纖維化及其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響果指數(shù)及肝功能變化指數(shù)數(shù)的變化可間接反映出小鼠肝纖維化發(fā)生過(guò)程肝臟大體標(biāo)驗(yàn)結(jié)果得出，與空白組比較，CCl4組肝臟指數(shù)明顯升高，義（p<0.01）；與 CCl4組比較，CCl4+Met 組肝臟指數(shù)一組高，差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）（圖 1-1）。

圖 1-2 血清中 ALT、AST 含量Figure 1-2 Contents of ALT and AST in serum4.2 各組小鼠肝臟組織病理染色及結(jié)果分析4.2.1 肝臟 HE 染色正常小鼠肝臟內(nèi)肝小葉正常，肝細(xì)胞索整齊排列，間質(zhì)內(nèi)無(wú)炎性細(xì)胞與正常組比較，CCl4組小鼠匯管區(qū)內(nèi)出現(xiàn)粗大的膠原纖維條索分割包繞，隔明顯增厚，肝小葉結(jié)構(gòu)明顯異常，有假小葉形成，肝細(xì)胞索排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；與 CCl4組相比，CCl4+Met 治療組，膠原纖維的增生減小葉的形成改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕（圖 1-3）。

圖 1-2 血清中 ALT、AST 含量Figure 1-2 Contents of ALT and AST in serum4.2 各組小鼠肝臟組織病理染色及結(jié)果分析4.2.1 肝臟 HE 染色正常小鼠肝臟內(nèi)肝小葉正常，肝細(xì)胞索整齊排列，間質(zhì)內(nèi)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與正常組比較，CCl4組小鼠匯管區(qū)內(nèi)出現(xiàn)粗大的膠原纖維條索分割包繞，纖維間隔明顯增厚，肝小葉結(jié)構(gòu)明顯異常，有假小葉形成，肝細(xì)胞索排列紊亂，間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；與 CCl4組相比，CCl4+Met 治療組，膠原纖維的增生減輕，假小葉的形成改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕（圖 1-3）。
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