第一節(jié)HBX在體外對(duì)肝臟卵圓細(xì)胞增殖的直接促進(jìn)作用 目的:研究乙型肝炎病毒編碼X蛋白在體外對(duì)肝臟卵圓細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用. 方法:運(yùn)用熒光顯微鏡觀察及Western blot對(duì)穩(wěn)定表達(dá)HBX的大鼠肝臟卵圓細(xì)胞系HBX-EGFP-LE/6進(jìn)行鑒定。以轉(zhuǎn)染HBX細(xì)胞系HBX-EGFP-LE/6為實(shí)驗(yàn)組,轉(zhuǎn)染標(biāo)記綠色熒光蛋白空載體EGFP-LE/6、LE/6細(xì)胞系為對(duì)照組,通過(guò)MTT細(xì)胞增殖活力實(shí)驗(yàn)及EDU摻入實(shí)驗(yàn)比較三組細(xì)胞DNA合成速度。 結(jié)果:HBX在部分細(xì)胞克隆穩(wěn)定高表達(dá),對(duì)照組細(xì)胞未檢測(cè)到HBX表達(dá)。HBX對(duì)肝臟卵圓細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用,在同步化后培養(yǎng)24h、48h、72h,與對(duì)照組相比,HBX-EGFP-LE/6卵圓細(xì)胞系增殖加快,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。在血清刺激后,與對(duì)照組相比,HBX-EGFP-LE/6卵圓細(xì)胞系DNA合成加快,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。 結(jié)論:細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并表達(dá)的HBX蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的肝臟卵圓細(xì)胞的增殖具有直接促進(jìn)作用,并且促進(jìn)其S期DNA合成。 第二節(jié)HBX對(duì)卵圓細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的調(diào)控作用 目的:研究HBX對(duì)肝臟卵圓細(xì)胞中細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)水平的影響,探討HBX促進(jìn)肝臟卵圓細(xì)胞增殖的分子基礎(chǔ)。 方法:穩(wěn)定表達(dá)HBX基因的肝臟卵圓細(xì)胞克隆為實(shí)驗(yàn)組,表達(dá)綠色熒光蛋白的空載體組和LE/6卵圓細(xì)胞為對(duì)照組。Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclinD1、CDK2、CDK4、p21、p27的表達(dá)水平 結(jié)果:與對(duì)照組相比,cyclinD1的蛋白表達(dá)水平在HBX-EGFP-LE/6細(xì)胞中顯著上調(diào),p27蛋白的表達(dá)輕微下調(diào)。 結(jié)論:HBX在肝臟卵圓細(xì)胞中影響細(xì)胞周期相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平,可能是其促進(jìn)肝臟卵圓細(xì)胞增殖的分子基礎(chǔ)之一。 第三節(jié)HBX對(duì)肝卵圓細(xì)胞MAPK信號(hào)及AKT信號(hào)的影響 目的:研究HBX在卵圓細(xì)胞LE/6中對(duì)MAPK通路信號(hào)的影響,探討HBX促進(jìn)LE/6卵圓細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。 方法:穩(wěn)定表達(dá)HBX基因的HBX-EGFP-LE/6肝臟卵圓細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,表達(dá)綠色熒光蛋白的空載體組和LE/6卵圓細(xì)胞為對(duì)照組;Western blot檢測(cè)了ERK、AKT、JNK、p38、p-ERK、pAKT、p-JNK、p-p38在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組卵圓細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。 結(jié)果:與對(duì)照組比較,在HBX-EGFP-LE/6中,p-ERk、p-Akt的表達(dá)水平升高。但ERK、Akt、JNK、p38、p-p38、p-JNK在三種細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。 結(jié)論:胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的HBX蛋白可以在體外培養(yǎng)的肝臟卵圓細(xì)胞中上調(diào)ERK、AKT信號(hào)。 第四節(jié)HBX上調(diào)cyclinD1表達(dá)并促進(jìn)肝臟卵圓細(xì)胞增殖依賴于HBX上調(diào)的ERK及AKT信號(hào) 目的:研究HBX促進(jìn)卵圓細(xì)胞增殖及上調(diào)cyclinD1是否依賴于HBX-EGFP-LE/6內(nèi)上調(diào)的ERK和/或AKT信號(hào) 方法:穩(wěn)定表達(dá)HBX基因的HBX-EGFP-LE/6肝臟卵圓細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組,表達(dá)綠色熒光蛋白的空載體組和LE/6卵圓細(xì)胞為對(duì)照組;運(yùn)用特異性信號(hào)通路抑制劑LY294002,PD184352阻斷卵圓細(xì)胞MEK/ERK及PI-3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),然后在指定時(shí)間點(diǎn)western blot檢測(cè)cyclinD1在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況; MTT檢測(cè)阻斷干預(yù)72h后各組細(xì)胞的增殖活性。 結(jié)果:抑制劑PD184352阻斷通路72h后,干預(yù)組HBX-EGFP-LE/6細(xì)胞較未干預(yù)組細(xì)胞增殖活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。抑制劑PD184352阻斷通路72h后,干預(yù)組HBX-EGFP-LE/6細(xì)胞較未干預(yù)組細(xì)胞增殖活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。HBX-EGFP-LE/6細(xì)胞中的CyclinD1蛋白高表達(dá)水平在兩種抑制劑分別作用后均不能維持。 結(jié)論: HBX上調(diào)的卵圓細(xì)胞增殖活性和CyclinD1表達(dá)水平,依賴于HBX上調(diào)的ERK及AKT信號(hào)。 第一節(jié)HBX降低肝臟卵圓細(xì)胞對(duì)TGFβ1增殖抑制效應(yīng)敏感性 目的:研究卵圓細(xì)胞中HBX蛋白對(duì)TGFβ1增殖抑制效應(yīng)的影響。方法: HBX-EGFP-LE/6卵圓細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組, LE/6和EGFP-LE/6卵圓細(xì)胞作為對(duì)照組。運(yùn)用Real-time和estern blot檢測(cè)三組卵圓細(xì)胞中TGFβ受體2 mRNA及蛋白表達(dá)水平。MTT試驗(yàn)比較外源性TGFβ1在三組卵圓細(xì)胞中的增殖抑制效應(yīng)。結(jié)果: TGFβ受體2在HBX- EGFP-LE/6中的m RNA及蛋白表達(dá)水平均下調(diào)。MTT表明外源性TGFβ1在對(duì)照組細(xì)胞中具有更強(qiáng)的增殖抑制效應(yīng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。結(jié)論:HBX影響卵圓細(xì)胞對(duì)TGFβ1增殖抑制效應(yīng)的敏感度,可能與TGFβ受體2的基因表達(dá)水平下調(diào)有關(guān)。 目的:研究乙型肝炎病毒編碼X蛋白HBX對(duì)肝臟卵圓細(xì)胞中TGFβ/smad中核心元件samd2、samd3、samd4表達(dá)的調(diào)控作用。 方法:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBX基因的大鼠卵圓細(xì)胞株HBX-EGFP-LE/6作為實(shí)驗(yàn)組,轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白標(biāo)記空載體的大鼠卵圓細(xì)胞株EGFP-LE/6,大鼠卵圓細(xì)胞株LE/6作為對(duì)照組檢測(cè)TGFβ/smad信號(hào)通路中的核心元件smad2、smad3、samd4的表達(dá)情況。Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HBX-EGFP-LE/6,以及對(duì)照組EGFP-LE/6,LE/6中smad2、smad3、smad4的mRNA表達(dá)水平,western blot檢測(cè)三組細(xì)胞中smad2、smad3、smad4蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果:與對(duì)照組相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBX基因的大鼠卵圓細(xì)胞株HBX-EGFP-LE/6中smad2的mRNA及蛋白表達(dá)水平未有顯著變化。smad3、smad4的mRNA表達(dá)水平有顯著降低(p0.05),Smad3蛋白表達(dá)水平有一定程度降低,smad4蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化。 結(jié)論:乙型肝炎病毒編碼X蛋白可以在卵圓細(xì)胞中影響TGFβ/smad信號(hào)通路中的核心元件smad3的轉(zhuǎn)錄及蛋白合成,對(duì)samd4的轉(zhuǎn)錄有一定影響,對(duì)smad2的表達(dá)沒(méi)有顯著作用。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R512.62
【部分圖文】：

細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照。其中 4、17、19 號(hào)克隆高表達(dá) HBX 基因E/6 細(xì)胞中無(wú) HBX 表達(dá)。觀察 HBX-EGFP-LE/6、EGFP-LE/6 細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)/6、EGFP-LE/6 不同細(xì)胞克隆中均可見(jiàn)強(qiáng)度不等的綠色熒光。1 、E2 各組細(xì)胞綠色熒光陽(yáng)性率＞95％。

圖 1 HBX-L02 細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照。其中 4、17、19 號(hào)克隆高表達(dá) HBX 基因。對(duì)照EGFP-LE/6、LE/6 細(xì)胞中無(wú) HBX 表達(dá)。2、熒光顯微鏡觀察 HBX-EGFP-LE/6、EGFP-LE/6 細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)情況。HBX-EGFP-LE/6、EGFP-LE/6 不同細(xì)胞克隆中均可見(jiàn)強(qiáng)度不等的綠色熒光。其中 XX17、X19、E1 、E2 各組細(xì)胞綠色熒光陽(yáng)性率＞95％。

表一 MTT 檢測(cè)六組卵圓細(xì)胞增殖活性（mean±SD,n=6）h LE/6 E1 E2 X4 X17 X1912 0.25±0.03 0.23±0.03 0.25±0.02 0.25±0.02 0.24±0.02 0.23±0.0224 0.25±0.04 0.25±0.03 0.24±0.03 0.29±0.03 0.29±0.03 0.29±0.0348 0.44±0.04 0.43±0.05 0.44±0.09 0.58±0.06 0.56±0.07 0.58±0.0672 0.64±0.07 0.63±0.08 0.63±0.05 1.02±0.09 1.00±0.11 0.99±0.19

【共引文獻(xiàn)】

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1 吳斌,楊威;血友病A基因治療的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(兒科學(xué)分冊(cè));2004年04期

2 康文英;血友病A基因治療的靶細(xì)胞研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).輸血及血液學(xué)分冊(cè);2001年06期

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2 曹亮;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向肝細(xì)胞分化及不同細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)分化率的影響[D];大連醫(yī)科大學(xué);2005年

3 陳鐵軍;利用大鼠Y染色體特異性PCR技術(shù)檢測(cè)卵圓細(xì)胞源性肝癌細(xì)胞[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2833240