丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是導致慢性肝炎、肝硬化甚至肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的主要原因之一。目前尚缺乏有效的疫苗,標準治療方案是采用干擾素(interferon,IFN)聯(lián)合利巴韋林(ribavirin,RBV),但部分患者療效不理想。影響治療效果的因素眾多,包括宿主及病毒因素等。近年研究發(fā)現(xiàn)宿主基因多態(tài)性與HCV感染轉(zhuǎn)歸相關(guān),相繼報道了人類白細胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)、IFN刺激基因和IL28B等。其中IL28B基因多態(tài)性對抗病毒治療應答和病毒自然清除具有較好的預測價值。然而,在攜帶有危險等位基因的純合子型人群中,仍有1/3的人獲得了持續(xù)病毒學應答(sustained virological response,SVR),所以單純考慮宿主因素并不能解釋丙型肝炎抗病毒治療的療效,病毒對IFN治療的影響也同樣值得注意。 HCV編碼的多種病毒蛋白可通過影響細胞內(nèi)眾多信號傳導級聯(lián)反應而改變正常的應答途徑導致IFN抵抗。相關(guān)機制研究較多,包括E2的糖基化結(jié)構(gòu)抑制干擾素介導的蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)通路以保護HCV不被清除;HCV NS3/4A影響干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3,IRF-3)信號傳導,導致內(nèi)源性免疫逃逸及外源性干擾素治療抵抗;HCV NS5A蛋白C端2209-2248位氨基酸殘基形成的干擾素敏感決定區(qū)(interferon sensitivity determining region,ISDR),與PKR結(jié)合后抑制PKR生物活性,但以上研究目前尚存在較大的爭議。近年來研究認為HCV核心蛋白可作用于信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)家族,通過抑制JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導通路進而減少干擾素刺激基因(interferon stimulate gene,ISG)的轉(zhuǎn)錄;與核轉(zhuǎn)錄因子作用影響固有免疫應答因子,最終降低ISG表達。這些成果為深入研究HCV核心蛋白干擾素抵抗機制提供了大量的基礎(chǔ),使HCV核心蛋白成為研究HCV致病機制和防治的熱點。本研究運用生物信息學工具預測HCV核心蛋白與IFN療效相關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能,并通過臨床觀察研究驗證,探討HCV核心蛋白與IFN療效相關(guān)的特征結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域中氨基酸變異及與IFN療效的關(guān)系。實驗方法和結(jié)果如下: 一、HCV核心蛋白結(jié)構(gòu)及功能的生物信息學預測 利用生物信息學工具對HCV各基因型核心蛋白進行氨基酸序列分析及二、三級結(jié)構(gòu)預測,并預測其可能存在的功能模序,綜合分析比較HCV核心蛋白中存在的與IFN治療敏感性相關(guān)的結(jié)構(gòu)區(qū)域并分析型間差異。結(jié)果顯示: 1、HCV核心蛋白二級結(jié)構(gòu)無規(guī)卷曲比例高而不易形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),2-45氨基酸可能存在螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix)的三級結(jié)構(gòu)。 2、HCV核心蛋白16-36氨基酸可能與人解旋酶的DEAD box結(jié)構(gòu)(DDX3)結(jié)合,2-23氨基酸可能與STAT1結(jié)合,可能與IFN抵抗有關(guān)。 3、HCV核心蛋白中可能存在磷酸化等多種修飾位點及與SH2、SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的區(qū)域,可能調(diào)節(jié)不同信號轉(zhuǎn)導通路影響IFN作用。 二、HCV核心蛋白變異與干擾素療效相關(guān)性的實驗研究 收集115例接受IFN聯(lián)合RBV治療的丙型肝炎患者并進行長期隨訪觀察。治療前進行HCV基因分型,并對患者血清HCV RNA進行動態(tài)監(jiān)測,其中52例獲得持續(xù)病毒學應答(SVR)和26例未獲得持續(xù)病毒學應答(non-sustained virological response,N-SVR)的患者能成功擴增HCV核心(Core)區(qū)全長序列,對這部分患者Core區(qū)氨基酸序列進行比對分析,驗證生物信息學預測中與IFN治療敏感性相關(guān)的結(jié)構(gòu)區(qū)域及各型間差異的結(jié)果,并進行氨基酸變異統(tǒng)計分析。 1、HCV Core區(qū)結(jié)構(gòu)功能預測結(jié)果與第一部分相符。各基因型間氨基酸變異主要集中在1-40和70-110氨基酸區(qū)域。 2、aa4或aa91變異在SVR和N-SVR組的比較中有統(tǒng)計學意義,且Cys91變異的持續(xù)病毒學應答率有統(tǒng)計學意義。 全文結(jié)論: 1、HCV核心蛋白為二級、三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象不穩(wěn)定但可塑性好的蛋白,可能存在與DDX3和STAT等結(jié)合的區(qū)域及磷酸化、酰胺化等多種修飾位點和兩性蛋白SH3結(jié)構(gòu)域作用的區(qū)域。這些結(jié)構(gòu)特點和功能區(qū)域均有可能影響IFN治療效果,可能是核心蛋白抵抗IFN治療的分子基礎(chǔ)。 2、HCV核心蛋白與IFN療效相關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域中存在有統(tǒng)計學差異的氨基酸變異,推測這些氨基酸變異可能作為IFN治療反應性的預測因子。
【學位單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：R512.63
【部分圖文】：

圖 2 HCV 核心蛋白三級結(jié)構(gòu)表 3 各基因型 2-45 氨基酸替換Sitenotype Identity4 10 16 20 31 32 36 CV 1a 90.9% N/I K N Q V G L V 1b 90.9% N K N Q V G L CV 2 97.7% N K N Q/E V G L CV 3 72.7% L K/Q/I N/I/L Q/K V/Y G/V V RCV 4 N K N M/Q V G L CV 5 97.7% N K N M V G L CV 6 84.1% N/L K N Q V G L N、K、V、G、V、L、R 等分別為不同氨基酸縮寫

第三軍醫(yī)大學碩士學位論文表7 RT-PCR及PCR擴增引物引物名稱 起始位置 引物序列 長度(bp)CE1-ESP nt834 GCAACAGGGAACCTTCCTGGTTGCTC 26CE1-EAP nt1328 CGTAGGGGACCAGTTCATCATCAT 24CE1-IAP nt1316 GTTCATCATCATATCCCATGCCAT 245'UTR1 nt68 GCAGAAAGCGCCTAGCCATGGCGT 24

CE1區(qū)瓊脂糖凝膠電泳M：Marker；泳道1：CE1區(qū)PCR產(chǎn)物495bp

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳開慧;譚勇明;;丙型肝炎藥物研發(fā)進展[J];免疫學雜志;2011年07期

2 幸小弘;王志成;彭孝武;;美沙酮門診治療人員617例感染HIV和HCV分析[J];職業(yè)與健康;2011年12期

3 普冬;汪亞玲;趙勤;劉紅偉;吳芳華;;昆明地區(qū)HIV和HCV共感染者丙型肝炎病毒基因型特征[J];中國熱帶醫(yī)學;2011年06期

4 周永鑫;劉孝玉;;榆中縣400名吸毒人員哨點監(jiān)測HCV、HIV和梅毒感染狀況調(diào)查分析[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2011年08期

5 郝蘭虎;李艷萍;李卓榮;;抗丙型肝炎藥物研究進展[J];中國抗生素雜志;2011年05期

6 張振;趙子龍;徐麗;吳新姣;朱海珍;譚蔚泓;方曉紅;;基于核酸適體的丙肝病毒核心蛋白檢測新方法[J];中國科學:化學;2011年08期

7 曾勁峰;許曉絢;李活;葉賢林;陳華;曹玉峰;;核酸血篩在獻血者常規(guī)篩查中的應用研究[J];中國輸血雜志;2011年07期

8 何亞琴;張建偉;楊愛龍;濮云峰;莊華;;核酸檢測技術(shù)在常州地區(qū)獻血篩查中的應用[J];中國輸血雜志;2011年07期

9 歐陽瑞芳;;衡陽市雁峰區(qū)吸毒人員HBV/HCV/HIV及梅毒感染狀況分析[J];實用預防醫(yī)學;2011年08期

10 梁紅霞;張倩;余祖江;鈕正春;李志勤;潘延鳳;趙清霞;李建生;何云;;某艾滋病治療示范區(qū)HIV/AIDS患者合并HBV/HCV感染調(diào)查[J];醫(yī)藥論壇雜志;2011年12期

相關(guān)會議論文 前10條

1 程玲;洪國祜;郭艷;毛青;;HCV核心蛋白氨基酸變異與干擾素療效相關(guān)性研究[A];中華醫(yī)學會第五次全國艾滋病、病毒性丙型肝炎暨全國熱帶病學術(shù)會議論文匯編[C];2011年

2 許茹;;中國無償獻血人群HCV的部分基因序列測定和基因分型報道[A];中國輸血協(xié)會第五屆輸血大會論文專集（摘要篇）[C];2010年

3 朱立新;劉晶;李迎春;孔玉英;STAIB Caroline;SUTTER Gerd;汪垣;李光地;;HCV E2的復雜糖化依賴于全長核心蛋白序列[A];中國生物化學與分子生物學會第八屆會員代表大會暨全國學術(shù)會議論文摘要集[C];2001年

4 常燕子;陸蒙吉;楊東亮;;HCV核心蛋白對IFN-α誘導的抗病毒分子表達的影響及其機制[A];第六屆全國免疫學學術(shù)大會論文集[C];2008年

5 資源;馮德云;;2'-5'寡腺苷酸合成酶基因啟動子介導的重組Caspase-3治療系統(tǒng)誘導表達HCV核心蛋白HepG2細胞凋亡的體內(nèi)實驗[A];中華醫(yī)學會病理學分會2010年學術(shù)年會日程及論文匯編[C];2010年

6 王艷紅;王桂琴;;核心蛋白聚糖抑制腫瘤生長的研究進展[A];第6次全國微生物學與免疫學大會論文摘要匯編[C];2004年

7 馬強;李明;;HCV蛋白組學研究展望[A];全國寄生蟲學與熱帶醫(yī)學學術(shù)研討會論文集[C];2006年

8 張安軍;李貴來;;2種方法自制HCV弱陽性外部對照質(zhì)控血清的應用[A];中國輸血協(xié)會第五屆輸血大會論文專集（摘要篇）[C];2010年

9 洪國祜;郭艷;程玲;毛青;;中國HCV基因型分布模式的系統(tǒng)性分析[A];中華醫(yī)學會第五次全國艾滋病、病毒性丙型肝炎暨全國熱帶病學術(shù)會議論文匯編[C];2011年

10 俞小瑞;于杰;田夢玉;;腦中蛋白聚糖核心蛋白分子結(jié)構(gòu)的研究[A];中國生物化學與分子生物學會第八屆會員代表大會暨全國學術(shù)會議論文摘要集[C];2001年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 章惠;HCV蛋白酶抑制劑 BI201335有強效抗病毒活性[N];中國醫(yī)藥報;2011年

2 張加;FDA 批準HCV抗體快速血液檢測試劑[N];中國醫(yī)藥報;2010年

3 王丹;我國艾滋病疫苗進入Ｉ期臨床[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2004年

4 ;十大成果 2002中國醫(yī)藥科技呈現(xiàn)輝煌[N];科技日報;2002年

5 方彤 陳明蓮;肝炎研究新途徑——基因克隆化[N];健康報;2006年

6 萬同己;乙肝的基因治療[N];中國醫(yī)藥報;2004年

7 吳一福;重組腺病毒核糖核酸酶載體問世[N];中國醫(yī)藥報;2005年

8 王書林;艾滋病毒符呈之訴[N];人民法院報;2000年

9 本報記者 靖九江;探尋病毒性肝炎的未知世界[N];中國醫(yī)藥報;2002年

10 張曉松;我研制艾滋病疫苗進入臨床研究[N];人民日報;2004年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 鄢然;1b型HCV研究模型的建立及蝎源抗菌肽抑制HCV感染的初步探討[D];武漢大學;2010年

2 馮曉燕;丙型肝炎病毒核心蛋白不同區(qū)段致肝癌作用及機理研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2004年

3 陳維賢;丙型肝炎病毒核心蛋白抑制RNA干擾的機制研究[D];重慶醫(yī)科大學;2007年

4 高博;熒光素酶標記的HCV細胞模型的建立及其在藥物評價等方面的應用[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2011年

5 周小軍;新型HCV感染細胞模型及小鼠模型研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2012年

6 馮德云;肝細胞癌中信號轉(zhuǎn)導的異常及HCV核心蛋白對人肝細胞生物學特性和信號轉(zhuǎn)導通路的影響[D];中南大學;2004年

7 谷雨;TIP47在NAFLD和HCV感染導致的肝細胞脂肪變性中的作用及機制研究[D];第四軍醫(yī)大學;2012年

8 張麗穎;HCV 1b型全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立與特性鑒定[D];吉林大學;2009年

9 操海萍;核心蛋白聚糖（decorin）在腫瘤組織中的表達及基因重組decorin的克隆與表達的研究[D];吉林大學;2004年

10 帥麗芳;嚴密型四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)的肝臟特異表達的雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究[D];吉林大學;2006年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 趙芳;HCV核心蛋白長期穩(wěn)定表達小鼠模型的建立[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2010年

2 程玲;HCV核心蛋白與干擾素療效相關(guān)性研究[D];第三軍醫(yī)大學;2011年

3 劉玲玲;HCV核心蛋白對HepG2細胞Bax與Bcl-2表達的影響[D];南華大學;2011年

4 程曉明;應用雙砷熒光標記法觀察乙肝病毒核心蛋白細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的實驗研究[D];華中科技大學;2009年

5 程曉明;應用雙砷熒光標記法觀察乙肝病毒核心蛋白細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的實驗研究[D];華中科技大學;2009年

6 郭永利;HCV core抗原檢測系統(tǒng)的初步建立[D];廈門大學;2007年

7 張冬翠;HCV核心蛋白與NS4B對HepG2細胞Wnt1、β-catenin、c-myc及CyclinD1表達的影響[D];南華大學;2012年

8 資源;2'-5'寡腺苷酸合成酶基因啟動子介導的重組Caspase-3治療系統(tǒng)誘導表達HCV核心蛋白HepG2細胞凋亡的體內(nèi)實驗[D];中南大學;2010年

9 徐楠;青島口岸出入境人員丙型肝炎病毒核苷酸序列分析[D];青島大學;2006年

10 寧容;HCV核心基因特異性M1GS核酶的靶向切割活性研究[D];廣東藥學院;2009年

本文編號：2827693