研究目的膽汁淤積性肝病是由多種原因所致的膽汁淤積造成肝臟損傷的病理過程,可引起肝細(xì)胞損傷,炎癥反應(yīng),若持續(xù)進(jìn)展,可引起肝臟纖維化,最終發(fā)展稱肝硬化。目前,關(guān)于膽汁淤積造成肝損傷的具體分子機(jī)制仍不清楚,本研究旨在探索NF-κB信號通路在膽汁淤積性肝損傷中的作用機(jī)制。研究方法以小鼠膽總管結(jié)扎手術(shù)建立膽汁淤積性肝損傷模型,結(jié)扎2周后檢測各組小鼠血清標(biāo)本中肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)變化,肝臟組織HE染色觀察小鼠肝臟病理變化。通過免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)(IF)檢測相關(guān)蛋白表達(dá)定位。取結(jié)扎3天后各組小鼠肝臟組織標(biāo)本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,以檢測肝臟組織中促炎因子的mRNA水平表達(dá)變化,同時(shí)使用免疫印跡實(shí)驗(yàn)(WB)檢測組織中NF-κB信號通路相關(guān)指標(biāo)的蛋白表達(dá)差異。體外實(shí)驗(yàn)中,使用膽汁酸成分甘氨鵝脫氧膽酸(GCDC)或牛黃膽酸(TCA)刺激人正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞24小時(shí)后,熒光定量PCR檢測細(xì)胞因子和炎癥因子等mRNA表達(dá)水平變化,然后使用NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082與膽汁酸GCDC或TCA共同刺激LO2細(xì)胞24小時(shí)后,用熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測不同組之間相應(yīng)炎癥因子mRNA水平,用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測NF-κB信號通路蛋白的表達(dá)變化。最后體內(nèi)給予膽管結(jié)扎小鼠BAY 11-7082,2周后,檢測血清肝功能指標(biāo)ALT、AST變化,肝臟組織HE染色觀察肝臟病理變化。研究結(jié)果1.膽總管結(jié)扎術(shù)后2周,可見BDL組小鼠膽管明顯擴(kuò)張,膽管中大量膽汁潴留,HE染色顯示出現(xiàn)大量多發(fā)壞死灶,匯管區(qū)膽管增生,炎癥細(xì)胞浸潤明顯,肝功能指標(biāo)ALT、AST明顯上升。而假手術(shù)組是正常的。免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)提示BDL組在壞死灶區(qū)的蛋白RIP1和RIP3表達(dá)上升。2.膽管結(jié)扎術(shù)后3天,與假手術(shù)組相比,BDL組細(xì)胞因子IL-6,趨化因子IL-8、MCP-1、MIP-2、CCL20的mRNA表達(dá)水平明顯上升,WB實(shí)驗(yàn)顯示肝組織中的NF-κB p-p65和p-IκBα的蛋白水平上升。3.體外使用膽汁酸GCDC和TCA刺激LO2細(xì)胞24小時(shí)后,蛋白RIP1、RIP3表達(dá)上升。細(xì)胞因子IL-6,趨化因子IL-8、MCP-1、MIP-2、CCL20的mRNA水平上升明顯。p-p65、p-IκBα的蛋白水平上升,使用抑制劑BAY 11-7082和膽汁酸共同刺激24小時(shí)后,p-p65、p-IκBα的蛋白水平下調(diào),細(xì)胞因子IL-6,趨化因子IL-8、MCP-1、MIP-2、CCL20的mRNA的表達(dá)下降。4.體內(nèi)給與膽管結(jié)扎小鼠BAY 11-7082,2周后,與BDL組相比,血清中ALT、AST水平下降,HE染色顯示,予以小鼠BAY 11-7082后,肝臟壞死灶面積減少。研究結(jié)論小鼠膽總管結(jié)扎模型可以觀察到NF-κB信號通路的激活,并伴隨有下游炎癥因子的表達(dá)上調(diào)。在體外,膽汁酸可通過磷酸化IκBα,釋放NF-κB,激活NF-κB信號通路,并磷酸化NF-κB p65,促進(jìn)下游促炎基因的轉(zhuǎn)錄,該通路的激活能被NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082所抑制。體內(nèi)應(yīng)用BAY 11-7082,可以減輕膽管結(jié)扎所致肝損傷。膽汁酸通過激活NF-kB通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),但關(guān)于膽汁酸如何激活NF-κB通路以及膽汁淤積性肝損傷的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

22圖 1. 小鼠膽管結(jié)扎誘導(dǎo)膽汁淤積性肝損傷小鼠膽管結(jié)扎兩周后，A.小鼠術(shù)后解剖示膽管擴(kuò)張情況，B.小鼠肝臟組織切片HE 染色，C.小鼠血清 ALT 水平，D.小鼠血清 AST 水平。n=5, ***P<0.01，與Sham 組相比。.

圖 2. 膽管結(jié)扎小鼠肝組織促炎因子表達(dá)水平升高小鼠膽管結(jié)扎 3 天后，肝組織測序結(jié)果顯示炎癥因子表達(dá)水平，A、B、C、D、E 分別為 IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-2、CCL20 的 mRNA 水平，n=5, ***P<0.01，與 Sham 組相比。

圖 3. 膽管結(jié)扎小鼠肝組織 NF-κB 信號通路激活結(jié)扎 3 天后，檢測肝臟組織中 NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白，p-IκBα，Iκ65，p65 蛋白變化，β-Actin 為內(nèi)參。

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本文編號：2824840