第一部分肝細胞調控肝血竇內皮細胞促進肝再生機制研究研究背景和目的肝臟在遭受到外力損傷,化學毒物暴露,或者病毒感染時,具有顯著的再生能力,來維持肝臟的結構和功能。肝再生是一個由不同種類的細胞共同參與的持續(xù)的自然過程。小鼠肝部分切除模型(Partial Hepatectomy,PHx)是用來研究肝再生最經典的模型。在這個模型中,70%的肝臟被手術切除,剩下的肝臟增殖,大約術后1周,達到原來的肝臟體積,之后再生過程停止。肝再生是如何被觸發(fā)的,在再生過程中肝臟的結構和功能是如何保持的,哪些信號負責關閉生長反應是肝臟再生的三個主要問題。肝臟結構主要由肝實質細胞、肝血竇內皮細胞(Liver sinusoidal endothelial cell,LSEC)、肝內膽管上皮細胞、肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)、Kupffer細胞和細胞外基質組成。肝細胞增殖在前,非實質細胞再生隨后。正常組織結構恢復過程中,星狀細胞在部分肝切除術后約4天產生細胞外基質,重建肝細胞與其他細胞之間的連接。肝內血管系統(tǒng)主要由動脈、靜脈和LSEC構成。肝再生后期,勢必需要建立豐富的血管系統(tǒng)來維持新生肝細胞的存活,肝內血管再生離不開肝臟內特殊的毛細內皮系統(tǒng)。LSECs約占肝臟內細胞的15-20%,形成肝竇壁,參與了不同的生理和病理過程。肝細胞和LSECs的平衡對于肝再生穩(wěn)態(tài)的維持尤為重要,它有助于新生肝細胞的存活和肝臟功能保護。LSEC對肝細胞的增殖與終止是至關重要的,但啟動LSEC的再生過程仍不清楚。研究方案1.檢測PHx后肝細胞與LSEC增殖的時相,探討導致兩者時相差的原因;2.論證CRISPR-Cas9聯合AAV技術用于肝再生研究的可行性;3.基于CRISPR-Cas9聯合AAV技術構建特異性抑制肝細胞增殖的肝再生模型,觀察LSEC再生情況;4.篩查并驗證肝細胞調控LSEC再生的關鍵因子,明確調控機理;5.探討肝細胞對內皮前體細胞分化形成LSEC的影響。研究結果1.發(fā)現肝再生中,肝細胞增殖高峰早于LSEC增殖高峰的可能原因;2.首次論證了CRISPR-Cas9技術用于肝再生研究的可行性。3.基于CRISPR-Cas9技術構建了肝細胞特異性敲除OSMR(OSMR~(ΔHep))和Met(Met~(ΔHep))的肝再生模型,發(fā)現抑制肝細胞增殖后,LSEC以及肝臟內的血管再生滯緩,提示肝細胞啟動了LSEC再生過程;4.肝切除術后分離肝臟中的肝細胞、HSC、Kupffer和LSEC,分別進行了多因子篩查檢測,對比分析顯示肝細胞中促進內皮細胞生長的細胞因子VEGFA表達水平顯著上調,而抑制內皮細胞生長的細胞因子PEDF表達水平顯著下調;進一步結合OSMR~(ΔHep)以及Met~(ΔHep)模型,提示了肝細胞可能通過上調VEGFA以及下調PEDF來促進LSEC再生。5.體內注射VEGFA中和抗體以及PEDF因子,可以顯著滯緩LSEC再生;6.肝細胞特異性敲除VEGFA(VEGFA~(ΔHep))的小鼠肝切除術后,LSEC增殖滯后;而它在LSEC、Kupffer以及HSC內的敲除不影響肝體比恢復速率以及LSEC再生;肝細胞過表達PEDF(PEDF~(Hep))小鼠肝切除術后LSEC增殖滯后;以上實驗證實了肝細胞可通過上調VEGFA以及下調PEDF來促進LSEC再生;7.結合內皮前體細胞分析顯示,肝再生過程中,肝細胞可通過上調VEGFA及下調PEDF,促進骨髓中CD133陽性的內皮前體細胞動員、定植入肝,分化形成LSEC過程。結論我們的研究發(fā)現了肝再生過程中肝細胞可啟動LSEC再生,深入探討了肝細胞調控LSEC再生的方式,揭示了肝細胞影響骨髓CD133陽性內皮前體細胞分化形成LSEC的機理。肝再生早期伴隨著肝細胞的快速增殖,肝細胞通過上調VEGFA同時下調PEDF(PHx后第2-3天),促進LSEC的快速增殖;同時還促進骨髓中CD133陽性的內皮前體細胞,進入血液中(PHx后第2-3天),定植肝內(PHx后第2-4天),分化形成LSEC(PHx后第4-7天)。LSEC的部分再生過程依賴于骨髓內皮前體細胞定植分化,本研究結果解釋了為什么VEGFA和PEDF在肝細胞內變化高峰(PHx后第2-3天)與內皮細胞增殖高峰(PHx后第4-5天)存在2-3天的時間差。第二部分靶向和非靶向線粒體型抗氧化劑在肝癌防治中的不同作用研究背景和目的肝臟具有的獨特快速再生能力,可避免在急/慢性損傷或肝細胞死亡后對肝臟正常功能的影響。然而,在慢性損傷的情況下,驅動肝臟再生的分子機制是導致肝細胞癌變的主要危險因素,這也解釋了肝細胞癌的發(fā)生通常伴有慢性肝病的基礎,如肝硬化和慢性肝炎。伴隨著肝臟的損傷存在著持續(xù)的肝臟再生,其中,細胞積累活性氧簇與抗氧化調控失衡是導致致癌突變引發(fā)肝癌的主要原因之一。長久以來,人們普遍認為抗氧化劑能夠中和活性氧(ROS)來減少氧化應激產生的損傷,因此認為抗氧化劑具有一定的預防和輔助治療腫瘤的作用。然而越來越多的隨機對照實驗以及基礎研究表明結果與此相反,即抗氧化劑對腫瘤不但沒有防治作用,甚至某些特殊情況下還會增加腫瘤罹患的風險;這進一步說明了抗氧化劑在腫瘤預防中的雙重作用,而且抗氧化劑對不同種類的腫瘤作用也不同。此外,循證醫(yī)學提示抗氧化劑的種類也是會影響腫瘤預防的效果�？傮w而言,為了合理地使用抗氧化劑,需要區(qū)分腫瘤類型以及抗氧化劑的種類。然而,使用不同種類的抗氧化劑對肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)生的結局仍然未知。本文綜合國內外有關抗氧化劑在腫瘤預防和治療中的應用和進展,研究了靶向線粒體型抗氧化劑和非靶向型抗氧化劑在肝癌防治中的作用,分析了這兩類抗氧化劑促進或抑制腫瘤的具體機制,并提出抗氧化劑的類型是影響其用于肝癌防治不同效應的重要因素,從而為抗氧化劑在肝癌防治中的合理應用提供了理論依據。研究方案1.建立DEN和DEN聯合CCl4誘導的兩種肝癌模型,給予靶向線粒體型抗氧化劑和非靶向型抗氧化劑,研究兩類抗氧化劑對HCC形成的影響;2.檢測給予不同種類抗氧化劑后,肝細胞內總ROS和線粒體內ROS的變化情況,以明確這兩類抗氧化劑的作用部位;3.轉錄本測序分析抗氧化劑處理后肝臟樣本基因轉錄水平的變化;4.根據芯片數據探討抗氧化劑對肝細胞DNA損傷的影響和作用機制。5.檢測給予不同種類抗氧化劑后,DNA損傷,損傷反應相關蛋白以及修復相關蛋白在兩組之間的變化情況,明確調控機理;6.探討改變ATM/ATR活性對不同類型抗氧化劑防治HCC形成過程的影響。研究結果1.靶向線粒體型抗氧化劑(SS-31、Mito-Q)促進HCC的形成,非靶向線粒體型抗氧化劑(NAC、Trolox)抑制HCC的形成;2.非靶向線粒體型抗氧化劑降低了細胞內總的ROS;相比而言,靶向線粒體型抗氧化劑除降低細胞內總的ROS外,還特異性降低了線粒體內的ROS;3.轉錄本測序數據提示靶向和非靶向線粒體型抗氧化劑對肝細胞內氧化還原狀態(tài)的影響不同,多條信號通路分析提示它們對DNA損傷反應的影響不同;4.體內外實驗證實靶向線粒體型抗氧化劑促進了肝細胞中DNA損傷,非靶向線粒體型抗氧化劑則抑制了該損傷;5.升高SS-31降低線粒體內ROS,可以抑制SS-31所導致的DNA損傷;6.靶向和非靶向線粒體型抗氧化劑對肝細胞內DNA損傷反應以及DNA修復相關蛋白影響不同;7.靶向線粒體型抗氧化劑抑制ATM/ATR及其下游信號通路,促進ATM在線粒體內富集,并減少核內ATM分布;而非靶向線粒體型抗氧化劑進一步活化該通路,促進ATM核內富集,減少線粒體內ATM分布;8.改變ATM/ATR活性可逆轉不同類型抗氧化劑對HCC的防治效果。結論本研究發(fā)現了靶向線粒體型抗氧化劑和非靶向線粒體型抗氧化劑對化學誘發(fā)肝癌的不同防治效果;揭示了非靶向線粒體型抗氧化劑NAC和Trolox可促進原代肝細胞中DEN損傷的DNA修復過程,減緩了HCC形成;而靶向線粒體型抗氧化劑SS-31和Mito-Q則抑制了DNA修復,促進了HCC;闡述了靶向線粒體型抗氧化劑和非靶向線粒體型抗氧化劑在HCC防治中的不同作用與線粒體內ROS和非線粒體內ROS在HCC形成中的不同作用有關,線粒體內外ROS的失衡可能誘導了DNA損傷進而促進了HCC形成。
【學位單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R575
【部分圖文】：

圖 1 肝再生中肝細胞增殖高峰早于內皮細胞增殖高峰。Figure 1. Hepatocytes proliferation is prior to LSECs after hepatectomy.A) Representative fluorescent microscopy of liver sections obtained from wide typice after partial hepatectomy (PHx). Hepatocytes were marked by HNF4α (red), live

圖 2 CRISPR-Cas9 技術在肝再生模型中有效性的驗證Figure 2. The efficiency of CRISPR-Cas9 combined with adenovirous-associated virus(AAV) technology in liver regeneration mouse model.(A) Living body imaging of mice after injected with AAV.(B) Representative immunostaining of lucificanse in liver sections from Cas9-Alb-cre

圖 4 肝內各類細胞群中的細胞因子經篩查顯示，肝細胞來源的 VEGF 和 PEDF 調控了 LSEC 再生。Figure 4. Differential gene expression analysis of individual liver cell populationspresented hepatocyte-drived VEGF and PEDF to regulate LSEC proliferation.(A) qRT-PCR analysis of the biomarkers of isolated hepatocytes (Met), HSC (GFAP andDesmin), Kupffer (F4/80 and CD11b) or LSEC (Tie2 and VEGFR2) from wild type (WT)mice after PHx.(B) qRT-PCR analysis of the cytokines of promoting LSEC mitosis. VEGFA was thepossible cytokine. (n=4 animals)(C) qRT-PCR analysis of the cytokines of inhibiting LSEC mitosis. PEDF was thepossible cytokine.(D) qRT-PCR analysis of VEGFA and PEDF of isolated hepatocytes from WTOSMRΔHepand MetΔHepmice after PHx.(E) Quantification of VEGFA and PEDF by ELISA in liver sections from wild type miceafter PHx.

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本文編號：2820836