【摘要】：一、β-連環(huán)蛋白在TNF-α和Fas誘導(dǎo)急性肝損傷中的雙重作用機制研究研究背景和目的急性肝功能衰竭是一種常見的臨床危重癥,常導(dǎo)致多器官功能衰竭,在全世界范圍內(nèi)有極高的致死率。臨床上對于急性肝損傷的治療缺乏特異性治療手段,預(yù)后不理想。盡管原位肝移植是目前治療急性肝損傷的最有效手段,但是由于供肝來源短缺、手術(shù)風(fēng)險高、費用昂貴,且術(shù)后需長期服用免疫抑制劑,也導(dǎo)致大部分患者無法接受肝移植治療。急性肝衰竭的發(fā)生機制主要包括毒性物質(zhì)直接損傷細胞器引發(fā)細胞凋亡導(dǎo)致原發(fā)性肝損傷,以及肝毒性物質(zhì)刺激免疫系統(tǒng)活化引起繼發(fā)性肝損傷。因此,通過減輕細胞凋亡可作為治療急性肝損傷的新途徑。脂多糖(LPS)和D-半乳糖胺(GalN)聯(lián)合使用廣泛用于誘發(fā)小鼠急性肝損傷模型。TNF-α是在GalN/LPS模型中導(dǎo)致肝細胞凋亡的最重要因子。Fas誘導(dǎo)的肝細胞凋亡在免疫介導(dǎo)的肝臟疾病中起重要作用,Fas抗原在肝細胞內(nèi)高表達,因而肝細胞對Fas誘導(dǎo)的肝損傷十分敏感。給予小鼠注射抗Fas抗體(Jo2)會產(chǎn)生致死性肝損傷。β-連環(huán)蛋白(β-Catenin)是經(jīng)典Wnt信號通路中的關(guān)鍵蛋白,調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、分化以及凋亡。Wnt/β-Catenin信號通路的異常改變,尤其是β-Catenin的持續(xù)活化在多種腫瘤中都有發(fā)生,包括原發(fā)性肝癌。β-Catenin對細胞凋亡的調(diào)節(jié)作用十分復(fù)雜,在本研究室前期工作中發(fā)現(xiàn),肝細胞特異性敲除β-Catenin小鼠對GalN/LPS誘導(dǎo)的肝損傷敏感性降低,而對Jo2誘導(dǎo)的肝損傷反應(yīng)加重。β-Catenin在兩種肝毒性藥物誘導(dǎo)肝損傷過程中發(fā)揮雙重作用的機制還不清楚。本課題研究將利用肝細胞特異性β-Catenin敲除小鼠以及過表達β-Catenin的 Hepal6細胞系從體內(nèi)外兩方面對β-Catenin在急性肝損傷中的作用進行再一步驗證,并探討其發(fā)揮雙重作用的機制。材料和方法1.繁育肝細胞特異性敲除β-Catenin小鼠,小鼠的基因表型通過PCR驗證；2.分別通過腹腔注射GalN/LPS和Jo2,建立小鼠肝損傷模型,處理6hr后收集肝臟標(biāo)本；3.使用TUNEL法檢測肝細胞凋亡,Western blot檢測肝細胞凋亡相關(guān)蛋白PARP和Caspase3;4.應(yīng)用si-RNA技術(shù)沉默Hepal-6細胞中β-Catenin表達,沉默效率通過qRT-PCR和western blot檢測。應(yīng)用CCK-8檢測沉默β-Catenin后細胞對TNF-α和Jo2的細胞毒性作用；5.應(yīng)用免疫組化方法檢測肝組織p65核轉(zhuǎn)位,報告基因檢測Hepal-6細胞中NF-κB轉(zhuǎn)錄活性；6.應(yīng)用qRT-PCR方法檢鋇NF-κB下游靶基因SOD2和A20表達；7.應(yīng)用免疫共沉淀方法檢測β-Catenin和p65結(jié)合程度；8.含突變β-Catenin的腺病毒S37A用于感染Hepal-6細胞,建立過表達β-Catenin的Hepal-6細胞。過表達效率通過western blot,報告基因和qRT-PCI檢測；9.細胞免疫熒光檢測過表達β-Catenin后p65核轉(zhuǎn)位情況；10.應(yīng)用MDA試劑盒檢測過表達β-Catenin后Hepal-6對TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的作用；11.qRT-PCR和Western blot檢測肝組織中Fas的表達情況。12.應(yīng)用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。結(jié)果1.肝細胞特異性敲除β-Catenin減輕GralN/LPS誘導(dǎo)的肝細胞凋亡。Hepal-6細胞干擾β-Catenin表達后TNF-α誘導(dǎo)的肝細胞死亡減少,而過表達β-Catenin后肝細胞死亡增多。2.β-Catenin通過與NF-κB結(jié)合,影響NF-K B的轉(zhuǎn)錄活性。受GalN/LPS刺激后,肝細胞特異性敲除β-Catenin小鼠肝細胞中p65入核增加,下游靶基因A20和SOD2表達增加。Hepal-6細胞過表達β-Catenin后p65入核減少。3.肝細胞特異性敲除β-Catenin通過NF-κB加重GalN/LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Hepal-6細胞過表達β-Catenin后TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激減弱。4.β-Catenin與NF-κB結(jié)合影響Fas表達。肝細胞特異性敲除β-Catenin小鼠肝細胞Fas表達增加,肝臟對Jo2刺激的敏感性增加,肝損傷加重,細胞凋亡增加。結(jié)論本研究從動物和細胞水平證明β-Catenin在TNF-α和Fas所致的急性肝損傷中起不同作用。β-Catenin能夠加重由TNF-α誘導(dǎo)的肝細胞凋亡,這主要是通過β-Catenin同NF-κB結(jié)合,抑制了其轉(zhuǎn)錄活性所致。此外,β-Cater in還可加重TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。由于Fas的表達也受NF-K B調(diào)控,肝細胞特異性敲除β-Catenin小鼠Fas表達增高,因而加重了Jo2誘導(dǎo)的肝損傷。β-Catenin通過與NF-κB的相互作用調(diào)節(jié)TNF-α和Fas誘導(dǎo)的急性肝損傷。二、肝內(nèi)膽管細胞癌外顯子組單核苷酸多態(tài)性及插入缺失的檢測研究背景和目的肝內(nèi)膽管細胞癌(][ntrahepatic cholangiocarcinoma, ICC)是起源于外周(肝內(nèi))膽管上皮細胞的惡性腫瘤,是繼肝細胞癌之后最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤。由于缺乏特異的早期診斷分子標(biāo)志物,影像學(xué)特征不典型,因此早期診斷困難。且ICC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較早,因此診斷時患者多屬進展期,從確診至患者死亡的時間很短。如今疾病譜已悄然發(fā)生變化,ICC的發(fā)病率與死亡率正在逐漸增加。逐漸增加的發(fā)病率結(jié)合ICC高度惡性的生物學(xué)特征,使ICC迫切需要廣大醫(yī)務(wù)工作者以及研究人員的關(guān)注。外顯子組(Exome)是人類基因組全部外顯子的總稱,其作為蛋白質(zhì)的編碼區(qū),與人類約85%的致病突變相關(guān)。外顯子組測序以其高通量、價格低廉的優(yōu)勢,在近年來在腫瘤基因組的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。通過外顯子組測序能夠檢測蛋白質(zhì)編碼區(qū)內(nèi)的突變,通過預(yù)測突變對蛋白質(zhì)功能的影響,尋找致癌突變。本課題通過對8例ICC基因組及對照組織基因組進行外顯子組測序,尋找與ICC發(fā)生有關(guān)的單核苷酸多態(tài)性和短插入缺失突變,為尋找ICC的致病基因提供方向。材料和方法1.收集8例經(jīng)病理診斷明確的肝內(nèi)膽管細胞癌手術(shù)切除標(biāo)本,包括腫瘤組織、癌旁組織和遠端正常肝組織。2.應(yīng)用QIAamp DNA Mini Kit抽提肝組織基因組,用Roche NimbleGen V2 exomekit捕獲外顯子。3.外顯子測序應(yīng)用Illumina Solexa Hiseq2000平臺進行,采取雙末端(2×100bp)策略,測序深度為45倍。4.測序結(jié)果使用FastQC進行質(zhì)量監(jiān)控,BWA進行將序列比對到人類基因組參考序列(GRCh37.63)上,SAMtools對比對序列進一步篩選。5.突變通過、arScan檢測,隨后編寫Perl程序?qū)ν蛔兘Y(jié)果進行篩查。6.排除種系突變和已在dbSNP和1000Genome Project中報道的已知突變。7.應(yīng)用CooVar預(yù)測突變對氨基酸編碼的影響。8.篩選至少在兩例ICC中出現(xiàn)突變的基因,作為ICC相關(guān)的候選基因。結(jié)果1. FastQC質(zhì)量檢測顯示來自所有樣本的序列質(zhì)量均通過了質(zhì)量篩查。2.通過BWA序列比對和SAMtools篩選,約70%的序列匹配到人類基因組參考序列上。編碼區(qū)平均序列覆蓋深度達到47.2倍,約90.4%的編碼區(qū)序列覆蓋率至少達到10倍。3.經(jīng)突變檢測、質(zhì)量篩選和功能預(yù)測,共2550個突變對氨基酸編碼產(chǎn)生影響。23個基因在至少兩例ICC中存在突變。結(jié)論本試驗應(yīng)用外顯子組測序的方法對來自8例ICC患者的24例標(biāo)本進行了測序,首次對ICC外顯子組的單核苷酸多態(tài)性和插入缺失進行了檢測。共發(fā)現(xiàn)了23個基因,其突變可能與ICC有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575
【圖文】：

的邋ｓｉＲＮＡ（ｓｉ－邋ｅ邋－Ｃａｔｅｎｉｎ）和對照邋ＲＮＡ（ｓｉ－ｃｏｎｔｒｏｌ）轉(zhuǎn)染邋Ｈｅｐａｌ－６邋細胞邋３６ｈｒ邋后，ｑＲＴ－ＰＣＲ逡逑結(jié)果顯示：Ｓｉ－目－Ｃａｔｅｎｉｎ組Ｐ邋－Ｃａｔｅｎｉｎ邋�。藜捌湎掠窝セ颍茫铮玻澹茫欤椋睿模�，和Ｃ－Ｍｙｃ逡逑的表達量均低于對照組（圖２Ａ）。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測顯示干擾０邋－Ｃａｔｅｎｉｎ后目－Ｃａｔｅｎｉｎ逡逑蛋白水平低于對照組（圖２Ｂ）。ＴＮＦ－ａ是ＧａｌＮ／ＬＰＳ誘導(dǎo)肝細胞損傷的主要效應(yīng)因子，逡逑因此我們應(yīng)用ＴＮＦ－ａ刺激Ｈｅｐａｌ－６細胞，通過ＣＣＫ－８試驗觀察細胞殺傷效應(yīng)。Ｃｈｘ逡逑作為巧細胞對ＩＮＦ－ａ刺激的X椕艏�，同？Ｆ－ａ共同加葰鑴x澹穡幔歟斷赴小＃茫茫耍稿義鮮匝榻峁允荊裕危疲岷停茫瑁鳵G激６ｈｒ后，ｓｉ－邋Ｐ邋－Ｃａｔｅｎｉｎ和ｓｉ－ｃｏｎｔｒｏｌ組沒有差別；１２ｈｒ逡逑后，ｓｉ－ｃｏｎｔｒｏｌ組細胞死亡比例顯著高于ｓｉ－目－Ｃａｔｅｎｉｎ組（圖２Ｃ），提示與體內(nèi)結(jié)果相逡逑同

通過邋Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋Ｓｏｌｅｘａ邋Ｈｉｓｅｑ邋２０００邋平臺測序的序列，其質(zhì)量由邋Ｐｈｒｅｄ邋Ｑｕａｌｉｔｙ邋Ｓｃｏｒｅ逡逑表示。分數(shù)高于２０則表示堿基測序的準(zhǔn)確率大于９９％Ｐｉ’２２ｌ，因此我們將２０設(shè)為序逡逑列質(zhì)量分數(shù)的下限。結(jié)果如圖２所示，盡管由于ｍｕｍｉｎａ邋Ｓｏｌｅｘａ成對末端測序的策略逡逑會導(dǎo)致序列末端的質(zhì)量略低，但仍通過了我們所設(shè)定的質(zhì)量要求。因此所有序列都通逡逑過了質(zhì)量分析，可Ｗ進斤下一步試驗。逡逑５５逡逑

肝臟疾病中細胞調(diào)亡的機制逡逑肝細胞調(diào)亡在人類肝臟疾病中十分普遍。由于肝臟有極強的再生能力，少胞死亡對于人體的影響并不大。但是，持續(xù)肝細胞損傷會伴隨大量損傷－愈合導(dǎo)致肝細胞纖維化，甚至肝硬化。肝硬化難逆轉(zhuǎn)，其后遺癥（口靜脈高壓、肝病Ｗ及肝細胞癌）威脅患者的生命。本文將對調(diào)亡在肝臟疾病中的作用及其行回顧。逡逑調(diào)亡的分子機制逡逑調(diào)亡是一種非常保守、并受到精密調(diào)控的細胞自主有序的死亡。它能夠幫個體細胞卻不影響組織的生物學(xué)功能，從而維持組織的穩(wěn)態(tài)。調(diào)亡細胞的在組表現(xiàn)為調(diào)亡小體，即細胞核固縮、細胞皺縮，細胞膜空泡形成Ｗ。同壞死細胞這些調(diào)亡小體會被鄰近細胞或巨y細胞迅速吞枿，避免機體發(fā)生免疫應(yīng)答。但指出，一種定居在肝臟的巨唆細胞——枯否細胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ邋ｃｅｌｌｓ）在細胞調(diào)成持續(xù)的炎癥反應(yīng)Ｗ。逡逑ａｐｏｐ化ｓｉｓ邐？逡逑

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本文編號：2797663