發(fā)布時(shí)間：2020-08-18 14:02

【摘要】：研究背景及目的肝細(xì)胞癌(以下簡(jiǎn)稱肝癌)是原發(fā)性肝癌中最常見的形式,發(fā)病率居全球癌癥第六位,且全球超過(guò)一半的肝癌患病人群來(lái)自中國(guó)。肝癌通常預(yù)后極差,為癌癥相關(guān)死亡的第三大主要原因。大多數(shù)肝癌在慢性肝炎引起的嚴(yán)重肝纖維化和肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)。慢性肝炎病毒感染、酒精性肝病以及肝臟脂肪變性是肝硬化和肝癌的主要危險(xiǎn)因素。由于肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)與肝臟疾病的背景因素密切相關(guān),而肝纖維化則是肝臟疾病的主要病因之一,因此對(duì)于肝纖維化和肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究十分必要。天冬氨酰β-羥化酶(Aspartateβ-hydroxylase,ASPH)是一種α-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶,其發(fā)現(xiàn)源于有乙肝病史的肝細(xì)胞癌患者細(xì)胞系(FOCUS),可特異催化體內(nèi)某些蛋白質(zhì)中存在的表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域(Epidermal growth factor-like domain)中天冬氨酸或天冬酰胺殘基上β碳原子的羥化反應(yīng),并發(fā)揮其生物學(xué)功能。現(xiàn)階段關(guān)于ASPH的研究表明,ASPH在小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、惡性膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌、膽管癌及胰腺癌患者的腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì),并能夠影響腫瘤細(xì)胞的遷移能力和疾病進(jìn)展。本課題組亦發(fā)現(xiàn),ASPH的表達(dá)量增高與肝細(xì)胞癌的腫瘤進(jìn)展和臨床預(yù)后較差相關(guān)。同時(shí),有研究發(fā)現(xiàn)ASPH通過(guò)糖原合成激酶3β調(diào)控細(xì)胞衰老從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。然而,現(xiàn)階段ASPH的研究主要集中在其他惡性腫瘤領(lǐng)域和肝癌的臨床和細(xì)胞層面,而在肝纖維化領(lǐng)域及肝癌的動(dòng)物模型和尚無(wú)系統(tǒng)性的研究。前期工作中,本課題組發(fā)現(xiàn)肝癌患者的腫瘤組織中ASPH的表達(dá)量顯著高于癌旁組織,且肝纖維化組織中ASPH的表達(dá)亦顯著高于正常肝組織。同時(shí),在二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型和四氯化碳(CCl_4)誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中也觀察到實(shí)驗(yàn)組小鼠的ASPH表達(dá)量相較對(duì)照組顯著升高。因此,研究ASPH在肝癌和肝纖維化中的作用及其分子機(jī)制將有助于全面系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)該分子的生物學(xué)功能,并為ASPH這一分子靶點(diǎn)在肝病治療中的臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。研究方法1.利用臨床組織樣本研究ASPH和肝纖維化及肝癌的關(guān)系:結(jié)合課題組已有的肝癌中ASPH表達(dá)水平和患者預(yù)后數(shù)據(jù),利用定量PCR檢測(cè)患者肝纖維化組織和正常肝組織中ASPH的表達(dá)水平,用ASPH的抗體進(jìn)行免疫組化染色,在蛋白水平上檢測(cè)肝纖維化組織和對(duì)照肝組織中的ASPH表達(dá),研究ASPH和肝纖維化及肝癌的關(guān)系。進(jìn)一步將組織按照纖維化嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分(Ishak評(píng)分系統(tǒng)),研究ASPH表達(dá)和肝纖維化程度的相關(guān)性。肝星形細(xì)胞(HSCs)是肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞,我們通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)組織中HSC活化的指標(biāo),如CollagenαⅠ、TIMP-1、MMP-2、α-SMA和TGF-β1。同時(shí)采用免疫熒光法對(duì)組織進(jìn)行α-SMA和ASPH的特異染色,以明確ASPH在HSC中的特異表達(dá)情況。2.利用小鼠疾病模型研究ASPH和肝纖維化及肝癌的關(guān)系:根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法,我們通過(guò)小鼠腹腔注射四氯化碳(CCl_4)和膽總管結(jié)扎分別誘導(dǎo)兩種肝纖維化模型,并通過(guò)腹腔注射二乙基亞硝胺(DEN)和四氯化碳(CCl_4)誘導(dǎo)肝癌模型。同時(shí),我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)針對(duì)ASPH的His-2區(qū)域23外顯子進(jìn)行敲除,成功建立了ASPH基因敲除(ASPH~(-/-))小鼠,通過(guò)肝組織染色比較敲除小鼠和野生型小鼠中肝纖維化和肝癌的組織病理變化,并在對(duì)ASPH敲除小鼠和野生型小鼠的肝纖維化和肝癌組織進(jìn)行差異基因表達(dá)分析,用基因芯片技術(shù)檢測(cè)mRNA的變化,尋找差異表達(dá)的關(guān)鍵分子。同時(shí),為了檢測(cè)抑制ASPH的功能是否影響小鼠肝纖維化和肝癌的發(fā)生和進(jìn)展,我們?cè)谀Ｐ瓦^(guò)程中同時(shí)給予小鼠注射ASPH的小分子抑制劑MO-I-1100,以驗(yàn)證ASPH能否作為肝纖維化和肝癌治療的潛在靶點(diǎn)。3.利用肝星形細(xì)胞系研究ASPH對(duì)肝星形細(xì)胞活化和肝纖維化的影響:我們?cè)贖SC系Lx2中過(guò)表達(dá)ASPH,利用針對(duì)ASPH活性位點(diǎn)構(gòu)建的慢病毒特異性地敲除ASPH,并通過(guò)WB檢測(cè)ASPH的過(guò)表達(dá)和敲除水平,分析過(guò)表達(dá)和敲除ASPH后對(duì)肝星形細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響。同時(shí)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞的活化指標(biāo)CollagenαⅠ、TIMP-1、MMP-2、α-SMA和TGF-β1表達(dá)的影響。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示。多組間差異比較可采用One-way ANOVA法分析,Graphpad Prism 5.0軟件用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和制圖。將P0.05定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果1.本研究共收集34例肝纖維化組織樣本和36例正常肝組織樣本。相比于正常組織,肝纖維化組織中ASPH的表達(dá)顯著上升,進(jìn)一步將肝纖維化組織評(píng)分發(fā)現(xiàn),ASPH表達(dá)和肝纖維化程度呈線性正相關(guān)關(guān)系。2.CCl_4或BDL誘導(dǎo)的肝纖維化模型以及DEN和CCL4誘導(dǎo)的肝癌模型均構(gòu)建成功。在兩種模型中,野生型小鼠肝臟組織中ASPH表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組和假手術(shù)組。同時(shí),ASPH~(-/-)小鼠的肝硬化程度輕于野生型,表現(xiàn)為匯管區(qū)膠原沉積減少,纖維化指數(shù)較低,且肝臟組織中α-SMA、CollagenαⅠ、TIMP-1、MMP-2和TGF-β1的表達(dá)水平較野生型小鼠組明顯降低;類似地,ASPH~(-/-)小鼠誘發(fā)肝癌的直徑大小、數(shù)量均顯著低于野生型小鼠。3.利用小干擾RNA(siRNA)下調(diào)HSC中ASPH的表達(dá)或使用ASPH抑制劑(MO-I-1100)后,HSC細(xì)胞的增殖、遷移受到顯著抑制,且肝纖維化效應(yīng)分子表達(dá)顯著降低�；蛐酒瑱z測(cè)發(fā)現(xiàn),具有肝纖維化表型的野生型與ASPH~(-/-)小鼠相比,共有86個(gè)基因表達(dá)升高,259個(gè)基因表達(dá)降低,其中Cyp4a14基因差異倍數(shù)最大。選取Cyp4a14基因和通路驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn),ASPH~(-/-)小鼠中Cyp4a14顯著下調(diào)。通過(guò)siRNA下調(diào)HSC中Cyp4A14的表達(dá)后,HSC增殖、遷移均受到顯著抑制,且HSC活化的效應(yīng)分子CollagenαⅠ和α-SMA的表達(dá)亦顯著降低。結(jié)論ASPH在肝纖維化患者和小鼠中表達(dá)升高,ASPH敲除后小鼠肝纖維化和肝癌的嚴(yán)重程度減輕。抑制ASPH時(shí)HSC的活化程度減低。Cyp4a14可能作為ASPH的下游分子,直接或通過(guò)視黃醇代謝通路參與HSC的活化。因此我們推斷,ASPH可以通過(guò)Cyp4a14/視黃醇代謝通路促進(jìn)HSC活化從而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R575.2
【圖文】：

肝纖維化患者組織樣本中 ASPH 的表達(dá)量顯著高于正常對(duì)照（**，）縱坐標(biāo)：ASPH 的相對(duì)表達(dá)量；橫坐標(biāo)：正常肝組織對(duì)照組、肝。）ASPH 表達(dá)和肝纖維化程度正相關(guān)兩名病理學(xué)專業(yè)研究人員在盲法狀態(tài)下，根據(jù) Ishak 評(píng)分系統(tǒng)所提將肝纖維化患者 HE 染色后的組織切片進(jìn)行肝纖維化分期（1-6 期現(xiàn)，肝纖維化組織中 ASPH 的表達(dá)量和肝纖維化 Ishak 分期呈線性圖 1.3）（R2= 0.897，P<0.001）。

海軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文- 22 -圖1.3. 肝纖維化組織中ASPH的表達(dá)量和肝纖維化Ishak分期呈線性正相關(guān)關(guān)系（n = 34，R2= 0.897，P<0.001）縱坐標(biāo)：ASPH 的相對(duì)表達(dá)量；橫坐標(biāo)：Ishak評(píng)分區(qū)間。四、小結(jié)與討論本研究利用目前肝纖維化研究中較大病例樣本（n = 70）首次發(fā)現(xiàn)，ASPH在肝纖維化和肝硬化患者的肝臟組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，且 ASPH 的表達(dá)量與肝纖維化的分期存在著線性正相關(guān)關(guān)系。該結(jié)果為本研究下一步在動(dòng)物體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。既往關(guān)于 ASPH 的研究多數(shù)聚焦于惡性腫瘤，其認(rèn)為 ASPH 可影響腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有密切關(guān)系[15, 16, 18, 28-30]。在肝細(xì)胞癌患者中進(jìn)行的外科學(xué)臨床研究中普遍認(rèn)為，肝纖維化或肝硬化是肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的主要獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[31, 32]。因此

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【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 武燁曄;天冬氨酰-（天冬酰胺酰）-β-羥化酶在肝纖維化進(jìn)程中作用及機(jī)制的初步研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2016年

本文編號(hào)：2796308