【摘要】：MicroRNA(MiRNA)是一類19-25nt的單鏈非編碼微小RNA,廣泛存在于從病毒、線蟲到動植物的細胞中,在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制翻譯或裂解靶基因mRNA來負性調(diào)控靶基因的表達。已證實miRNA參與了包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等多種調(diào)節(jié)途徑。 研究發(fā)現(xiàn),除動植物細胞能編碼miRNA外,許多病毒也編碼了-niRNA。MiRNA注冊數(shù)據(jù)庫miRBase第19版已經(jīng)收錄了病毒來源的436個miRNAs分子,但這些病毒來源的miRNA絕大多數(shù)是DNA病毒所編碼,RNA病毒來源的miRNA屈指可數(shù)。目前,僅在逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒中的人免疫缺陷病毒(HIV)、牛白血病病毒(BLV)和非逆轉(zhuǎn)錄RNA病毒中的西尼羅河病毒(WNV)三種RNA病毒中發(fā)現(xiàn)病毒來源的miRNA,其他RNA病毒,特別是細胞質(zhì)復制的RNA病毒編碼的miRNA至今未見報道。甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus)類屬小核糖核酸病毒科肝病毒屬,是一種典型的細胞質(zhì)復制RNA病毒,其基因組為單股正鏈RNA。HAV在體外細胞培養(yǎng)中生長緩慢、復制周期長、復制效率低、不引起細胞病變,并形成持續(xù)性感染。這些獨特的特征提示,該類病毒極有可能像西尼羅河病毒一樣編碼功能性的miRNA來調(diào)控病毒在細胞中的復制和增殖。 本研究以細胞質(zhì)復制的單股正鏈RNA病毒甲型肝炎病毒(HAV)H2毒株為研究對象,分析其編碼miRNA的可能性,并對其編碼的miRNA進行預測和鑒定,同時探索其編碼miRNA的生物學途徑和所編碼miRNA的潛在生物學功能。 首先,我們利用VMir軟件和RNAstructure5.3軟件在HAV基因組RNA中發(fā)現(xiàn)4個潛在的pre-miRNAs莖環(huán)結(jié)構(gòu),分別為MD59、MD62、MD80和MD92,在負鏈RNA中發(fā)現(xiàn)有3個潛在的pre-miRNAs莖環(huán)結(jié)構(gòu),分別為MR37、MR49和MR62。利用同源片段搜索法預測pre-miRNA剪切后產(chǎn)生的成熟miRNA,結(jié)果顯示,這7個pre-miRNAs莖環(huán)結(jié)構(gòu)剪切后可能產(chǎn)生28種成熟的miRNAs序列。 其次,我們對生物信息學預測的miRNAs分子進行實驗驗證和生物學特征鑒定。首先通過stem-loop RT-PCR法證實了9個預測的成熟miRNAs在HAV感染的KMB17細胞中表達,我們將其作為候選miRNA并分別命名為：hav-miR-N1-5p、 hav-miR-N1-3p、hav-miR-D1-5p、hav-miR-D2-5p、hav-miR-N2-3p、hav-miR-D3a、 hav-miR-D3b、hav-miR-D4-3p、hav-miR-D4-5p。同時對這9個候選niRNAs進行基于RT-PCR的miRNA cDNA克隆及測序分析,結(jié)果顯示,9個候選miRNAs被擴增序列與預測的序列完全一致,進一步證明了這9個候選miRNAs在HAV感染的細胞中的確被表達。在獲得HAV來源的9個miRNAs序列后,我們對它們在細胞中的表達進行了poly (A)-tailed RT-PCR檢測,結(jié)果顯示9個miRNAs都能被特異性擴增。為了確定被克隆的miRNAs與預測的pre-miRNAs在結(jié)構(gòu)上的剪切關(guān)系,我們構(gòu)建了miRNA表達質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-HAV-miRNA,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染KMB17細胞和293T細胞后,預測的7個pre-miRNAs表達出9個成熟的miRNAs,從而證明了被克隆的成熟miRNAs是由預測的pre-miRNAs莖環(huán)結(jié)構(gòu)剪切而來。為了確定HAV編碼miRNA的生物學途徑,我們利用RNAi技術(shù)分別下調(diào)經(jīng)典miRNA合成途徑中的Drosha酶、Dicer酶、Exportin-5轉(zhuǎn)運蛋白和AG02蛋白的表達,并檢測四個蛋白的表達被分別下調(diào)后HAV編碼miRNAs水平的變化,結(jié)果證實HAV編碼miRNAs的過程是一個依賴Drosha酶、Dicer酶和AG02蛋白,而不依賴Exportin-5轉(zhuǎn)運蛋白的過程。為了確定候選的miRNAs是否具有典型miRNA所具有的PTGS (Post-transcriptional Gene Silencing)活性特征,我們利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析了9個候選miRNAs的PTGS功能活性特征,實驗結(jié)果表明：除hav-miR-N1-3p無PTGS活性特征外,其余8個是真正的具有PTGS功能活性特征的miRNAs分子。時序性表達分析表明,HAV編碼的8個miRNAs在病毒感染細胞后的4-8小時表達達到高峰,隨后維持在一個較低的水平。 再次,我們研究了HAV編碼的miRNA對病毒復制增殖的調(diào)控作用及作用的分子機制。靶基因預測顯示,HAV編碼的miRNAs與病毒基因組RNA或負鏈RNA的相應(yīng)區(qū)段完全互補。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實HAV編碼的miRNA對預測的靶基因具有強烈的表達抑制作用。在HAV與KMB17細胞互作系統(tǒng)中,利用"gain of function"和"loss of function"的功能研究策略,通過miRNA mimic和miRNA inhibitor上調(diào)和下調(diào)病毒感染細胞中miRNA的表達水平,在HAV亞基因組水平和基因組水平證實了HAV編碼的miRNA對病毒復制的抑制作用,并揭示了這種抑制作用的分子機制：miRNA以siRNA的作用方式順式裂解病毒的基因組RNA或負鏈RNA,通過病毒的這種自我靶向作用來抑制病毒基因組的復制,進而達到抑制病毒自身復制增殖的目的。 本項研究工作證實了一類新的由小RNA病毒編碼的miRNA分子,并描述了一種RNA病毒來源的miRNA非經(jīng)典的細胞質(zhì)加工途徑,同時也揭示了一種由miRNA介導的小RNA病毒在細胞中復制增殖調(diào)控的新機制。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.61;Q75

【共引文獻】

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本文編號：2788846