【摘要】： 第一部分 瘦素在肝纖維化組織中的表達研究 目的:探討瘦素在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中的表達及臨床意義。 方法:應用免疫組織化學方法檢測了30例肝組織,其中10例正常肝組織和20例肝纖維花組織,了解肝組織中瘦素的表達情況。 結果:與正常肝組織相比,瘦素在肝纖維化組織中的表達顯著增加(P0.01)。肝纖維化組織中膽小管上皮細胞和肝細胞呈瘦素免疫反應陽性。 結論:瘦素的異常表達與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展有關,提示瘦素參與了肝纖維化的病理過程。 第二部分 靶向瘦素基因的siRNAs真核表達質(zhì)粒篩選平臺的建立 目的:構建具有特異性瘦素(leptin)基因siRNA功能的表達載體,篩選有效的靶向瘦素基因的siRNA真核表達質(zhì)粒。 方法:以leptin為目的基因,以產(chǎn)生siRNA質(zhì)粒載體psiRNA-hH1neo為表達模板,細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄合成7對特異的siRNAs,即siRNA278、siRNA108、siRNA97、siRNA454、siRNA146、siRNA237、ssiRNA108,其中ssiRNA108為對照siRNA。構建能在真核細胞中表達的靶向瘦素基因的siRNAs重組質(zhì)粒,用酶切方法和測序法對重組體進行鑒定。應用脂質(zhì)體介導重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HSC,用MTT檢測細胞體外黏附能力。 結果:①酶切和序列測定表明,成功構建了靶向leptin的siRNAs表達載體;②與未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染外源重組質(zhì)粒的細胞,體外黏附能力受到顯著抑制,黏附抑制率在32.52%～87.82%間,在轉(zhuǎn)染psiRNA97、psiRNA108、psiRNAl46、psiRNA237、psiRNA278、psiRNA454、pssiRNA108后,細胞黏附率分別是32.52%、35.07%、69.80%、66.45%、55.45%、49.76%、87.82%。其中siRNA278、siRNA108、siRNA97、siRNA454的抑制效果較強。 結論:本研究構建的leptin siRNAs表達載體中siRNA278、siRNA108、siRNA97和siRNA454有較強的抑制HSC的黏附力。 第三部分 靶向瘦素基因的siRNAs對肝星狀細胞生物學活性的影響 目的:研究靶向leptin基因的siRNAs在大鼠肝星狀細胞中l(wèi)eptin表達情況及對HSC生物學特性的影響。 方法:把siRNAs真核表達載體轉(zhuǎn)入HSC細胞內(nèi),篩選穩(wěn)定細胞克隆,應用RT-PCR、Western blot、免疫細胞化學和流式細胞儀等方法,分析靶向leptin基因的siRNAs在HSC的表達及HSC細胞的增殖和、活化和膠原的沉積來評價siRNAs對活化型肝星狀細胞生物學活性的影響。 結果:靶向leptin基因的siRNAs在轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)可以下調(diào)基因的表達,抑制HSC的增殖、細胞的活化和膠原的沉積。 結論:靶向leptin基因的siRNAs通過抑制靶基因及下游基因的表達逆轉(zhuǎn)活化型HSC的生物學特征,因此為肝纖維化的基因治療提供一種新的方法。 第四部分 靶向leptin的siRNAs對瘦素信號轉(zhuǎn)導機制等的影響 目的:檢測靶向leptin的siRNAs對信號轉(zhuǎn)導蛋白p-STAT3和細胞因子TGFβ1的影響,初步探討siRNAs對leptin的信號傳導機制等的影響。 方法:采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染siRNAs重組質(zhì)粒,HSC細胞經(jīng)過300μg/ml G418篩選4周后收集細胞,采用RT-PCR和Western Blot和免疫組化方法檢測轉(zhuǎn)染細胞的TGFβ1和信號轉(zhuǎn)導相關蛋白p-STAT3的表達。 結果:與未轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染siRNAs后,HSC中p-STAT3、TGFβ1表達下降。 結論:p-STAT3、TGFβ1參與了leptin在肝纖維化中的信號轉(zhuǎn)導;siRNAs抑制信號轉(zhuǎn)導對于肝纖維化的治療有一定的前景。 第五部分 siRNA聯(lián)合α-干擾素抗肝纖維化的實驗研究 目的:實驗研究表明siRNA對肝星狀細胞有抑制作用。本實驗擬進一步研究α-干擾素(alpha-interferon,α-IFN)與靶向leptin的siRNA97單獨及聯(lián)合作用對肝星狀細胞體外活性的影響。 方法:構建靶向leptin的siRNA97,用α-IFN和siRNA97處理HSC,通過繪制細胞生長曲線、軟瓊脂集落形成實驗、流式細胞術(FCM)來研究其對細胞的增殖抑制作用,ELISA法測定細胞上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量,PCR-ELISA試劑盒測定細胞的端粒酶活性。 結果:與對照組相比,α-IFN和siRNA97均能明顯抑制HSC增殖(P0.05),α-IFN和siRNA97聯(lián)合應用時抑制作用較二者單獨作用時強(P0.01);細胞在軟瓊脂中集落形成率明顯下降(P0.01);可降低端粒酶活性的表達(P0.05);FCM顯示細胞周期移行被阻滯于G0/G1期;細胞上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量明顯降低(P0.01)。 結論:siRNA97聯(lián)合α-IFN的體外抗纖維化作用比單獨應用α-IFN和siRNA97效果好。 第六部分 奧曲肽對大鼠肝星狀細胞胞質(zhì)內(nèi)游離鈣及細胞增殖的影響 目的:探討在常氧和低氧條件下奧曲肽(octreotide)對大鼠肝星狀細胞(HepaticStellate Cell)胞內(nèi)游離鈣([Ca2+]i)及增殖的調(diào)節(jié)。 方法:采用鈣熒光探針(Fura-2/AM)負載培養(yǎng)的大鼠HSC,觀察常氧和低氧條件下培養(yǎng)48h后octreotide對HSC的[Ca2+]i的調(diào)節(jié),同時用四唑鹽(MTT)比色法比較不同濃度的octreotide對大鼠HSC增殖的影響。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)放免分析藥盒測cAMP、cGMP濃度。 結果:與常氧條件相比,低氧條件下HSC[Ca2+]i顯著升高(P0.01),其值分別為(137.7±7.8)和(293.2±12.4)nmol/L。500、800和1000μg/L octreotide在常氧狀態(tài)下可引起HSCs的[Ca2+]i降低(P0.05),其值分別為(92.5±2.5)、(83.8±2.3)和(76.6 ±2.2)nmol/L。低氧時500、800和1000μg/L octreotide可引起HSCs的[Ca2+]i降低 (P0.01),其值分別為(204.3μ7.4)、(174.1±4.8)和(156.6±6.6)nmol/L。常氧對照 組A值(0.232±0.016)明顯低于低氧對照組(0.533±0.036),(P0.01); 經(jīng)500、 800和1000μg/L octreotide處理后,無論是常氧還是低氧狀態(tài)下A值均明顯降低 (P0.01)。低氧條件下cAMP和cGMP含量不發(fā)生改變(P0.05);無論是常氧還 是低氧狀態(tài),經(jīng)過octreotide 500μg/L處理后,cAMP和cGMP含量增高(P0.05), 而octreotide 800、1000μg/L組更高(P0.01)。 結論:缺氧可通過第二信使系統(tǒng)促進HSC的增生,而octreotide無論常氧還是低 氧條件下劑量依賴性抑制HSCs增殖;cAMP、cGMP參與了對HSC的調(diào)節(jié)。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R575.2
【圖文】：

1.HE染色結果正常肝組織由有較清晰的肝小葉，肝小葉以中央靜脈為中心，四周是放射狀排列的肝細胞索和肝血竇，肝血竇內(nèi)可見枯否氏細胞，小葉間有門管區(qū)。見圖1。

圖1正常人的肝臟HExZooFig.1thenormalhumanliver圖2正常肝的leptin免疫組化ABCx200Fig.2inununohistoehemiealABCmethodoflePtininnormalliver圖3肝纖維化的leptin免疫組化ABCxZOOFig.3inununohistoehemiealABCmethod圖4肝纖維化的leptin免疫組化ABCx200Fig.4iln印unohistoehemiealABCmethodofleptininhepatiefibrosisofleptininhepatiefibrosis

圖3肝纖維化的leptin免疫組化ABCxZOOFig.3inununohistoehemiealABCmethod圖4肝纖維化的leptin免疫組化ABCx200Fig.4iln印unohistoehemiealABCmethodofleptininhepatiefibrosisofleptininhepatiefibrosis圖5肝纖維化的leptin免疫組化ABex200Fig.5immunohistoehemiealABCmethod圖6肝纖維化的leptin免疫組化ABCx200Fig.6ifnmunohistoehemiealABCmethodofleotininhepatiefibrosisofleptininhepatiefibrosis

【參考文獻】

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本文編號：2788143