【摘要】： 目的意義:嚴重燒傷后造成腸粘膜血流量下降,腸粘膜組織損傷及通透性增加,使腸道屏障功能障礙,造成腸道細菌移位,引發(fā)多器官功能障礙,是導致傷后高代謝的重要原因。因此促進嚴重燒傷后腸道修復,能減輕臟器炎癥反應,防止腸源性感染,改善代謝障礙,加快創(chuàng)面愈合,是臨床救治重要措施之一。腸道作為人體最大的內(nèi)分泌器官,其自身分泌許多腸道激素對腸道結構功能起著重要的保護作用,隨著近年來對胰高血糖素樣多肽-2(Glucagons like peptide 2,GLP-2)認識的不斷深入,發(fā)現(xiàn)其對腸道有特異性保護作用。且有廣泛臨床應用前景。 本研究利用基因重組技術設計構建了GLP-2原核表達載體并誘導表達,初步觀察其對燒傷后大鼠腸道及腸上皮細胞的保護作用,利用體外細胞模型,探討GLP-2促細胞增殖的作用機制及調(diào)控因素,為今后臨床應用提供理論依據(jù)。 材料與方法: 1.利用pET31b(+)表達載體,對GLP-2序列進行重組設計,構建表達質(zhì)粒進行原核表達,優(yōu)化條件后表達并進行親和層析純化、脫鹽。溴化氰裂解后行western blot(WB)鑒定,并低溫干燥保存。 2.采用30%TBSAⅢ度燒傷大鼠模型作為體內(nèi)實驗模型,隨機分為正常對照組(N);燒傷對照組(C);重組GLP-2治療組(Gr)及化學合成GLP-2治療組(G)。檢測大鼠傷后第7天腸粘膜通透性,腸粘膜濕重與腸段及軀殼重比,腸粘膜蛋白及腸道病理形態(tài)學的變化。RT-PCR及WB檢測GLP-2R的表達,利用脂質(zhì)體基因轉染構建穩(wěn)定表達GLP-2R的Caco-2/GLP-2R(+)細胞作為體外研究模型,隨機分為正常對照組(N);缺氧對照組(C);缺氧后重組GLP-2處理組(Gr)及缺氧后化學合成GLP-2處理組(G)。觀察不同GLP-2對缺氧后細胞增殖、乳酸脫氫酶及蔗糖酶活性的影響,并檢測細胞CDK4及ZO1蛋白表達的變化。 3.構建caveolin-1/pEGFPN2質(zhì)粒及體外合成caveolin-1 siRNA后瞬時轉染Caco-2/GLP-2R(+)細胞,將細胞分為正常對照組(AN)、缺氧對照組(AC)、缺氧后GLP-2處理組(AG)、caveolin-1上調(diào)細胞缺氧后GLP-2處理組(CG)、caveolin-1下調(diào)細胞缺氧后GLP-2處理組(EG),檢測細胞cAMP濃度,GRK2(ser280)磷酸化蛋白變化及細胞增殖,同時應用信號通路抑制劑觀察GLP-2信號轉導,WB檢測ERK信號轉導通路中相關蛋白及Akt(ser473)蛋白磷酸化表達的變化,免疫共沉淀檢測caveolin-1與GLP-2R的作用,。觀察GLP—2對缺氧后細胞增殖信號轉導途徑的影響以及caveolin-1對GLP-2R跨膜信號的調(diào)控 結果: 1.成功設計構建GLP-2/pET31b(+)質(zhì)粒質(zhì)粒,測序正確;在BLR(DE3)感受態(tài)大腸桿菌種誘導表達最佳條件為1mMIPTG誘導表達4h,通過親和層析純化及溴化氰裂解法獲得單體GLP-2約100mg,重組得率5mg/100ml。 2.給予重組GLP-2及合成GLP-2后,燒傷后第7天,與燒傷對照組相比,大鼠的腸粘膜通透性明顯降低,腸粘膜蛋白含量、腸粘膜與腸段重及與軀殼重之比均明顯升高(P＜0.05),而兩種GLP-2之間差異無顯著性意義(P＞0.05)。形態(tài)學觀察兩種GLP-2均能減輕燒傷后腸粘膜病理損傷。體外實驗結果顯示,細胞嚴重缺氧8h立即加入1000nM的GLP-2,24、72h后能夠明顯增加Caco-2/GLP-2R(+)細胞的細胞增殖(P＜0.05),重組GLP-2與合成GLP-2效果無明顯差別(P＞0.05)。而GLP-2處理72小時后,細胞乳酸脫氫酶及蔗糖酶活性無明顯變化(P＞0.05)。CDK4及ZO1蛋白表達較缺氧對照組增強。 缺氧后立即給予1000nM的GLP-2處理,24h后,缺氧對照組cAMP含量明顯降低(P＜0.01),而GLP-2處理組的cAMP卻維持在一個較高水平。CG組細胞的cAMP明顯增加,而EG組cAMP含量下調(diào)。GLP-2處理24h后,能夠明顯增加缺氧細胞的增殖(P＜0.05),在CG組細胞增殖更加明顯(P＜0.05),EG組增殖作用下降。GLP-2處理后30min,磷酸化GRK2蛋白表達較缺氧對照組增強,無論上調(diào)或下調(diào)caveolin-1后,磷酸化GRK-2表達下降。給予不同信號通路抑制劑后發(fā)現(xiàn),MEK1/2特異性抑制劑U0126及PI3特異抑制劑LY294002能夠明顯抑制GLP-2的促增殖作用(P＜0.05),而P38特異性抑制劑SB203580卻不能抑制GLP-2促增殖作用。。缺氧后給予GLP-2能增強ERK信號途徑中c-Raf、MEK1/2、ERK1/2及核內(nèi)p90RSK磷酸化蛋白的表達,也能增強PI3信號途徑中Akt磷酸化蛋白的表達。caveolin-1上調(diào)后ERK信號通路中相關磷酸化蛋白的表達增強增強,caveolin-1下調(diào)后相關磷酸化蛋白的表達減弱。 結論: 1.構建GLP-2原核表達載體。誘導表達純化,為GLP-2獲得提供了一種新的方法。 2.重組GLP-2及化學合成GLP-2能夠降低嚴重燒傷后大鼠腸粘膜通透性,增加粘膜重量及蛋白含量,減輕腸粘膜的損傷程度。對Caco2/GLP-2R(+)細胞具有明顯的促增殖作用,但對細胞無明顯毒性,對蔗糖酶活性沒有明顯的影響,能夠增強缺氧后細胞CDK4及ZO1蛋白表達,可能參與了細胞分裂及細胞間緊密連接的調(diào)控機制。 3.GLP-2對細胞的促增殖作用伴有cAMP的增加,而磷酸化GRK2蛋白負反饋機制可能參與了對cAMP的調(diào)控。GLP-2對細胞增殖的作用依賴于ERK及PI3途徑,其可以引起c-Raf,MEK1/2,ERK1/2及P90RSK磷酸化蛋白表達增強,也使Akt磷酸化蛋白表達增強。而可能不依賴于P38信號途徑。Caveolin-1對GLP-2R信號轉導可能有調(diào)控作用,本實驗中,其可促進GLP-2介導的細胞增殖及激活ERK,PI3信號途徑。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R644;R574
【圖文】：

0.050圖2一1.*-一﨑一*，一.一正常組燒傷組重組GLP一2組合成GLP一2組注:與燒傷組相比，**.P<0刀1。GLP一2對燒傷后大鼠腸粘膜通透性的影響 (FITc一 Dmg/l們，x士s) 1.2GLP一2對燒傷后大鼠粘膜濕重/腸段，濕重/軀殼重以及粘膜蛋白含量的影響:燒傷后7d，燒傷組大鼠腸粘膜與腸段重及與軀殼重之比較正常組均明顯下降(P<0.05)，腸粘膜蛋白含量也明顯減低(P<0.05)。說明燒傷后腸粘膜功能受到損傷，而給予GLP一2后7d

圖2一4.GLP一2對燒傷后大鼠腸粘膜蛋白含量的影!l向(mg/g濕重，x士s)1.3GLP一2對燒傷后大鼠腸道病理損傷的影響:正常大鼠空腸粘膜絨毛完整，致密且排列整齊(圖2一5)，燒傷后大鼠傷后第7天，腸粘膜絨毛明顯變短，脫落，排列紊亂，間質(zhì)水腫，散在較多炎細胞浸潤，基底層變薄(圖2一6)。而GLP一2組傷后7d損傷比燒傷組有所減輕，粘膜下輕度水腫，絨毛排列較為規(guī)則，長短較為一致，未見明顯的上皮脫落，基底層完整。重組GLP一2與合成GLP一2無明顯區(qū)別(圖2一7，2一8)

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