【摘要】：肝纖維化是包括肝硬化、病毒性肝病、酒精性肝病等慢性肝病發(fā)展過(guò)程中所共有的階段,腸道微生物及其代謝物與肝纖維化進(jìn)程有一定相關(guān)性。脫硫弧菌是硫酸鹽還原菌在生物體內(nèi)的重要成員之一,與腸道炎癥等疾病密切相關(guān)。短鏈脂肪酸是腸道微生物的重要代謝產(chǎn)物,具有許多生理作用。本論文研究了脫硫弧菌對(duì)正常小鼠、CCl_4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠的肝纖維化發(fā)展及其腸道短鏈脂肪酸合成的影響,主要工作如下:(1)建立了UPLC測(cè)量糞便樣品中短鏈脂肪酸含量的方法。首先對(duì)腸道中可能存在的短鏈脂肪酸種類(lèi)進(jìn)行調(diào)研,對(duì)11種報(bào)道過(guò)的短鏈脂肪酸進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描,流動(dòng)相優(yōu)化,柱溫優(yōu)化,流速及洗脫程序優(yōu)化和內(nèi)標(biāo)選擇。并對(duì)所建方法的線(xiàn)性、保留時(shí)間、檢測(cè)限、定量限、回歸方程、準(zhǔn)確度及精密度等指標(biāo)進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。將所建立方法與常用氣相色譜法進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果顯示此方法能在10分鐘內(nèi)快速分離11種短鏈脂肪酸,其加標(biāo)回收率為98.15-106.07%,精密度為0.58-7.33%,并有良好的線(xiàn)性,可用于糞便中短鏈脂肪酸的檢測(cè)。新建立的UPLC法單次分析時(shí)間短,可檢測(cè)短鏈脂肪酸數(shù)量多,更適合于糞便樣品的檢測(cè)。(2)肝纖維化模型動(dòng)物腸道中脫硫弧菌的差異性分析。通過(guò)對(duì)CCl_4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠糞便脫硫弧菌含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),造模10周的小鼠與未造模小鼠脫硫弧菌含量相比增高近19倍(p0.01),提示脫硫弧菌在腸道中過(guò)量增殖與肝纖維化存在一定相關(guān)性。(3)將脫硫弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌液(NC+ATCC 29577組)及富集菌液(NC+Df-enrichment組)灌胃正常小鼠,通過(guò)qRT-PCR法確認(rèn)了外源脫硫弧菌可引起正常小鼠體內(nèi)脫硫弧菌的增加(~(***)p0.001)。對(duì)小鼠肝指數(shù)、組織切片天狼猩紅染色等表觀(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)表明,與對(duì)照組(NC+PBS組)相比,NC+ATCC 29577組及NC+Df-enrichment組肝指數(shù)分別增高26.3%及30.5%(~*p0.05),實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織血管附近均出現(xiàn)顯著的膠原蛋白沉積,膠原蛋白前體物質(zhì)羥脯氨酸分別升高了64.7%及49.4%(~(**)p0.01)。血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)測(cè)定結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組小鼠肝組織損傷均顯著性增加(p0.05)。兩實(shí)驗(yàn)組小鼠α-SMA基因表達(dá)分別增高270.4%及303%(~(***)p0.001),Col1基因表達(dá)分別增高近17倍及23倍(~(**)p0.01,~(***)p0.001)。上述結(jié)果表明正常小鼠在灌胃外源脫硫弧菌一段時(shí)間后,均出現(xiàn)了肝纖維化。對(duì)CCl_4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠灌胃標(biāo)準(zhǔn)菌液(CCl_4+ATCC 29577)及富集菌液(CCl_4+Df-enrichment),僅CCl_4+ATCC29577組小鼠腸道脫硫弧菌含量較模型組(CCl_4+PBS)增加28.87%(p0.05)。兩組小鼠肝指數(shù)、肝臟羥脯氨酸、肝纖維化相關(guān)基因α-SMA及Col1與CCl_4+PBS組相比無(wú)明顯差異。與CCl_4+PBS組相比,CCl_4+ATCC 29577組ALT、AST顯著性增加(p0.05),而CCl_4+Df-enrichment組AST水平也有顯著性增高(p0.05)。采用滅活菌液探究小鼠脫硫弧菌含量,結(jié)果顯示滅活菌液并無(wú)法引起正常小鼠糞便脫硫弧菌含量的增加(p0.05),其肝指數(shù)、肝臟羥脯氨酸含量等檢測(cè)結(jié)果也表明該組小鼠沒(méi)出現(xiàn)肝纖維化現(xiàn)象。(4)CCl_4+ATCC 29577及CCl_4+Df-enrichment小鼠肝組織中硫化氫含量較NC+PBS組出現(xiàn)顯著性下降(~(***)p0.001),而在血清中硫化氫含量較NC+PBS組相比增加26.2%及21.2%(~(**)p0.01,~(***)p0.001)。肝臟硫化氫合成相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果表明灌胃脫硫弧菌可上調(diào)CSE表達(dá)并下調(diào)CBS基因表達(dá),趨勢(shì)與CCl_4造模后相同,表明脫硫弧菌可能是通過(guò)影響機(jī)體中硫化氫代謝進(jìn)而影響肝臟纖維化,而糞便中硫化氫含量與血清出現(xiàn)相同的升高。對(duì)糞便樣品SCFAs含量進(jìn)行分析,CCl_4+ATCC 29577及CCl_4+Df-enrichment組的乙酸含量較CCl_4+PBS提升近16%(~#p0.05),表明脫硫弧菌對(duì)乙酸代謝相關(guān)菌群影響較大。此外CCl_4+Df-enrichment組在丁酸及戊酸含量較CCl_4+PBS組亦有顯著性增加(~#p0.05),表明脫硫弧菌富集菌液對(duì)丁酸及戊酸相關(guān)代謝菌群有一定關(guān)聯(lián)。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R575
【圖文】：

第一章 緒論SRB 可通過(guò)氧化還原作用利用硫酸鹽產(chǎn)生 H2S 進(jìn)入血液中發(fā)揮其生理作用。肝臟是硫化氫合成的重要部位之一，合成途徑如圖 1-1 所示。H2S 是生物體內(nèi)重要的氣體分子，已被證明與心血管系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)有密切的關(guān)聯(lián)，它可舒張血管平滑肌，降低血壓，有效保護(hù)心血管[46]。然而，當(dāng)體內(nèi) H2S 濃度累積到一定濃度時(shí)，可能抑制丁酸鹽氧化，引發(fā)細(xì)胞凋亡[47]。小鼠體內(nèi)的硫化氫代謝主要通過(guò) SRB 將腸道中血紅素類(lèi)化合物轉(zhuǎn)化為

江南大學(xué)碩士論文SCFAs 在腸道中的濃度并不完全相同，以盲腸與近結(jié)腸段最高[54]。膳食纖維在內(nèi)的微生物轉(zhuǎn)化結(jié)果合成了三種主要的 SCFAs：醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽。乙酸鹽丙酮酸通過(guò)乙酰 Co-A 生成的，也可以通過(guò) Wood-Ljungdahl 通路產(chǎn)生。丁酸是由兩子的乙酰輔酶 a 合成的，產(chǎn)生乙酰乙酰 Co-A，通過(guò) β-羥基丁基 Co-A 和巴豆酰基 C進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為丁基 Co-A。丙酸鹽可由 PEP 通過(guò)琥珀酸途徑或丙烯酸酯途徑形成，乳被還原為丙酸酯。微生物也可以通過(guò)丙二醇途徑從脫氧己糖（如海藻糖和鼠李糖）生丙酸[56]。

20流動(dòng)相對(duì)短鏈脂肪酸分離色譜圖（a）10 mM H2SO4（b）乙腈-NaH2PO-NaH2PO4hromatograms of different mobile phase for analysis of SFCAs (a) 10 mM HAcetonitrile- NaH2PO4(c) Methanol- NaH2PO4注：1.甲酸，2.乙酸，3.丙酸，4.丁酸確定結(jié)果標(biāo)物質(zhì)的保留時(shí)間及與各分析物分析效果分析，草酸、檸檬酸min 內(nèi)，與待測(cè)的甲酸、乙酸分離效果較差，通過(guò)改變流速及分離效果。而 2-乙基丁酸出峰時(shí)間介于正戊酸及 3-甲基戊酸之的分離效果，適合用于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。各內(nèi)標(biāo)物保留時(shí)間隨流速變

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本文編號(hào)：2768942