【摘要】：背景和目的由毒素或藥物引起的急性肝損傷是威脅患者生命的常見疾病。在西方國家,藥物性肝損傷(Drug induced liver injury,DILI)是急性肝衰竭和肝臟移植的重要原因之一。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在多種不同原因引起的肝損傷中,發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,是肝臟疾病機制研究的新熱點。肌醇依賴酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1α)是最保守的ERS傳感器。IRE1α磷酸化激活后,可以通過其核糖核酸內(nèi)切酶活性,特異性地剪切X-BOX結(jié)合蛋白1(x-box binding protein 1,XBPl)mRNA,產(chǎn)生強促轉(zhuǎn)錄作用的sXBPl轉(zhuǎn)錄因子。sXBPl啟動下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達,從而阻止錯誤蛋白質(zhì)翻譯或促進蛋白質(zhì)正確修飾以緩解ERS。IRE1α-XBP1信號是ERS重要調(diào)控通路。STF-083010是IRE1α核糖核酸內(nèi)切酶特定抑制劑,可特異性阻斷IRE1α-XBP1信號通路。近年研究顯示,STF-083010在多種肝損傷模型中具有抗氧化、抗炎癥作用。然而,STF-083010對硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)誘導(dǎo)的急性肝損傷是否具有保護作用尚不清楚。因此,本文擬探討STF-083010是否對TAA誘導(dǎo)的小鼠肝損傷發(fā)揮保護作用,以及其相關(guān)機制。方法1.建立TAA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型。體內(nèi)實驗驗證IRE1α-XBP1信號通路參與TAA誘導(dǎo)的肝損傷6-8周齡雄性C57BL/6J小鼠,隨機分成TAA組(n=6)、CON組(n=6)分別腹腔注射200 mg/Kg中毒劑量硫代乙酰胺(TAA)及等體積PBS。TAA組小鼠分別于0,6,12,24 h時間節(jié)點處死。分別收集小鼠血清及肝臟組織。應(yīng)用全自動生化分析儀檢測小鼠血清ALT、AST水平;取部分小鼠肝組織置入10%中性福爾馬林溶液中固定,用于蘇木素-伊紅(haematoxylin and eosin,HE)染色觀察肝臟組織變性壞死情況;蛋白免疫印跡(Western blot)測定IRE1α,p-IRE1α,sXBP1表達情況。2.體內(nèi)實驗驗證STF-083010對TAA誘導(dǎo)的急性肝損傷、ROS及炎癥反應(yīng)影響6-8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機分4組:TAA組(n=12)腹腔注射500 mg/Kg致死劑量TAA;TAA+STF(30mg/kg)組(n=12)予TAA處理前2小時腹腔注射STF-083010(30mg/Kg);TAA+STF(50mg/kg)組(n=12)予TAA處理前2小時腹腔注射STF-083010(50mg/Kg);TAA+STF(70mg/kg)組(n=12)予TAA處理前2小時腹腔注射STF-083010(70mg/Kg),生存實驗對比4組死亡率,并確定STF-083010干預(yù)有效濃度。在肝損傷實驗中,6-8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機分成4組:CON組(n=6)腹腔注射等體積PBS;TAA組(n=6)腹腔注射200 mg/Kg中毒劑量TAA;STF組(n=6)腹腔注射STF-083010(50mg/Kg),TAA+STF組(n=6):200 mg/Kg TAA處理前2小時腹腔注射STF-083010(50mg/Kg),予24小時節(jié)點處死小鼠,分別收集小鼠血清及肝臟組織。使用全自動生化分析儀檢測各組血清中ALT、AST水平;采用HE染色觀察各組肝臟組織變性壞死情況,TUNEL法觀察比較各組肝細胞凋亡變化。DHE染色法測定各組肝臟ROS生成情況。qRT-PCR檢測各組肝臟組織中促炎細胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β表達情況。3.體內(nèi)實驗驗證STF-083010在TAA誘導(dǎo)肝損傷小鼠中是否觸發(fā)自噬及其調(diào)控靶點6-8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機分成6組:CON組(n=6)腹腔注射等體積PBS;TAA組(n=6)腹腔注射200 mg/Kg中毒劑量TAA;STF組(n=6)腹腔注射STF-083010(50mg/Kg);TAA+STF組(n=6):200 mg/Kg TAA處理前2小時腹腔注射STF-083010(50mg/Kg);CQ組(n=6):腹腔注射CQ(60mg/Kg);TAA+STF+CQ組(n=6):200 mg/Kg TAA處理前2小時腹腔注射STF-083010(50mg/Kg),前1小時腹腔注射CQ(60mg/Kg).予24小時節(jié)點處死小鼠,收集血清及肝臟組織。Western blot測定各組p-IRE1α,sXBP1,LC3B,p62,Beclin-1表達情況。選取CON組、TAA組、TAA+STF組及TAA+STF+CQ組為研究對象,應(yīng)用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST水平;采用HE染色觀察各組肝臟組織變性壞死情況,TUNEL法觀察比較各組肝細胞凋亡變化。DHE染色法測定各組肝臟組織ROS生成情況。qRT-PCR檢測各組肝促炎細胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β。4.體外實驗證實STF-083010通過促進自噬改善TAA誘導(dǎo)肝細胞氧化應(yīng)激和肝毒性分離培養(yǎng)小鼠原代肝細胞。為了驗證STF-083010是否對TAA處理肝細胞具有保護作用。給予原代肝細胞不同濃度TAA處理后(0,10,20,30,40,50,60,70,80及90μM),在添加/不添加STF-083010(10mM)干預(yù)條件下,常規(guī)培養(yǎng)6h。CCK-8法測定肝細胞活力,擬合函數(shù)曲線,計算TAA半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。分別構(gòu)建Beclin-1-siRNA特異性敲低肝細胞Beclin-1及non-specific-siRNA(NS-siRNA)轉(zhuǎn)染細胞株。研究對象分成六組:CON組:等體積PBS處理肝細胞;STF組:10mM STF-083010溶解于PBS處理肝細胞;TAA組:70μM TAA溶解于PBS處理肝細胞。TAA+STF組:70μM TAA+10mM STF-083010溶解于PBS處理肝細胞;TAA+STF+NS-siRNA組:70μM TAA+10mM STF-083010溶解于PBS處理NS-siRNA轉(zhuǎn)染肝細胞;TAA+STF+Beclin-1-siRNA組:70μM TAA+10mM STF-083010溶解于PBS處理Beclin-1-siRNA轉(zhuǎn)染肝細胞。常規(guī)培養(yǎng)6小時,收集細胞上清,Western blot測定各組p-IRE1α,sXBP1,LC3B,p62,Beclin-1表達情況。采用DCFDA ROS檢測試劑盒測定肝細胞ROS水平。乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測定肝細胞毒性,CCK-8法測定肝細胞活力。結(jié)果1.TAA誘導(dǎo)的小鼠肝損傷在24小時內(nèi)逐漸加重。TTA組與CON組相比較,血清學(xué)檢測AST、ALT水平逐漸升高,HE染色提示肝組織損傷加重,壞死區(qū)域增多。Western blot檢測顯示隨著時間延長,p-IRE1α,sXBP1表達逐漸上調(diào),而IRE1α蛋白表達無變化。并且,以上變化在24小時節(jié)點達到高峰。2.生存實驗顯示,單獨致死劑量TAA處理組小鼠在48小時內(nèi)均死亡(100%)。低劑量STF-083010(30mg/kg)組小鼠死亡率與TAA組相似。然而,更高劑量的STF-083010(50mg/kg)顯著降低了TAA誘導(dǎo)的死亡率(67%),差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。提示STF-083010顯著降低了TAA誘導(dǎo)的死亡率。但是,進一步增加STF-083010至70mg/kg,小鼠死亡率未獲得改善。因此,確定STF-083010的有效濃度為50mg/kg。在肝損傷實驗中,STF+TAA組與TAA組相比較,AST、ALT水平顯著下降,HE染色顯示肝臟壞死區(qū)域減少,TUNEL法觀察到肝細胞凋亡明顯減少,差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。DHE染色法測定顯示TAA組較CON組活性氧產(chǎn)物明顯增多,qRT-PCR結(jié)果顯示TAA組較CON組促炎細胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β等表達上調(diào)。而,給予STF預(yù)處理(即TAA+STF組)肝臟活性氧產(chǎn)物及炎癥因子表達均出現(xiàn)明顯減少。3.Western blot結(jié)果提示,STF+TAA組與TAA相比較,sXBP1表達明顯降低,而自噬標志分子LC3B表達升高、p62表達降低,自噬啟動子Beclin-1表達顯著升高,差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果提示STF+TAA雙干預(yù)時,可能通過上調(diào)激活Beclin-1啟動自噬。進一步使用自噬抑制劑CQ體內(nèi)封閉自噬后,STF+TAA+CQ組與STF+TAA組相比,AST、ALT水平顯著升高,HE染色顯示肝臟壞死區(qū)域增加,TUNEL法觀察到肝細胞凋亡明顯增多,DHE染色法測定顯示活性氧產(chǎn)物明顯增多,qRT-PCR結(jié)果顯示促炎細胞因子TNF-α、IL-6及IL-1β等表達上調(diào)。差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。4.體外實驗結(jié)果顯示,STF-083010顯著提高了TAA IC50水平(TAA組IC50=47.32μM vs TAA+STF組IC50=62.19μM)。TAA組與CON組比較,p-IRE1α,sXBP1蛋白表達上調(diào),差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。STF+TAA組與TAA組比較,sXBP1表達下調(diào),Beclin-1表達上調(diào),自噬標記分子LC3B表達上調(diào),P62表達下調(diào)。肝細胞ROS水平下降。肝細胞產(chǎn)生的LDH減少,肝細胞活力增加。差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。使用siRNA技術(shù)特異性敲低Beclin-1結(jié)果顯示,TAA+STF+Beclin-1-siRNA組與TAA+STF+NS-siRNA組相比:肝細胞ROS水平升高。肝細胞產(chǎn)生的LDH增加,肝細胞活力下降。差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論1.IRE1α-sXBP1信號參與TAA誘導(dǎo)的小鼠肝損傷,其信號強度與肝損傷的嚴重程度相關(guān)2.STF-083010可以通過阻斷IRE1α-XBP1信號通路,上調(diào)Beclin-1表達,激活Beclin-1依賴的自噬,從而改善TAA引起的小鼠肝臟損傷、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575
【圖文】：

n=6）給予腹腔注射 200mg/Kg 中毒劑量 TAA。分別于 TAA 處理 收集血清。檢測血清 ALT 水平。sXBP1 信號參與 TAA 誘導(dǎo)急性肝損傷的發(fā)展們評估了 TAA 誘導(dǎo)的急性肝損傷的時間進程。如圖 2A-TAA 誘導(dǎo)的肝損傷在 24 小時內(nèi)逐漸加重，表現(xiàn)為 ALT/ 傷加重，壞死區(qū)域增多。Western blotting 檢測 IRE1α蛋白質(zhì)含量(圖 2D)。我們發(fā)現(xiàn)隨著 TAA 誘導(dǎo)時間延長，白質(zhì)表達量逐漸升高（p< 0.05）。而 IRE1α表達無變RE1α-sXBP1 信號參與 TAA-誘導(dǎo)的急性肝損傷的發(fā)展。

圖 2：TAA 誘導(dǎo)小鼠肝臟中 IRE1α-sXBP1 信號通路被激活。小鼠（n=6）給予腹腔注射200mg/Kg 中毒劑量 TAA .分別于 TAA 處理后 6h、12h、24h 收集肝臟組織及血清。(A, B) 血清 ALT、AST 水平； (C) HE 染色代表性圖像(×100), 評估肝臟壞死情況；(D) Western blot分析肝臟組織中 IRE1α, p-IRE1α及 sXBP1 蛋白表達水平。β-actin 設(shè)置為內(nèi)參。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。*p< 0.05, 與 CON 組比較。3.STF-083010 可減輕 TAA 誘導(dǎo)的急性肝損傷3.1.使用一種特定的 IRE1α核糖核酸酶抑制劑：STF-083010,抑制體內(nèi) IRE1α-sXBP1 信號。我們發(fā)現(xiàn) STF-083010 顯著降低了 TAA 誘導(dǎo)的死亡率。如圖 3A所示，單獨致死劑量 TAA 處理組小鼠在 48 小時內(nèi)均死亡（100%）。低劑量STF-083010 (30mg/kg)組小鼠死亡率與 TAA 組相似。然而，更高劑量的STF-083010 (50mg/kg)顯著降低了 TAA 誘導(dǎo)的死亡率(67%),差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。提示 STF-083010 顯著降低了 TAA 誘導(dǎo)的死亡率。但是，進一步增加 STF-083010 至 70mg/kg，小鼠死亡率未獲得改善。因此，確定 STF-083010

南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3.2.根據(jù)前期實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn) TAA 誘導(dǎo)的小鼠肝損傷在 24 小時節(jié)點最嚴重，達到峰值。因此，后期所有觀察節(jié)點選擇為 24 小時節(jié)點。如圖 3B-D 所示，與 TAA 組相比，STF-083010 明顯減輕了 TAA 誘導(dǎo)的肝損傷。表現(xiàn)為：TAA+STF組血清 ALT/AST 水平降低，HE 染色見肝壞死面積減少（p< 0.05）。我們也通過TUNEL 染色來評估肝細胞的凋亡。結(jié)果表明，STF-083010 對 TAA+STF 組小鼠肝細胞凋亡具有明顯的抑制作用，表現(xiàn)為 TUNEL 陽性細胞較 TAA 組減少（圖 3E）（p< 0.05）。以上結(jié)果表明，STF-083010 可以減輕 TAA 誘導(dǎo)的急性肝損傷。

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本文編號：2768806