【摘要】：研究背景潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)是一種炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD),它是由多種原因引起的慢性和復發(fā)性腸道炎癥�？捎绊懘竽c和回腸,臨床表現(xiàn)為腹瀉,腹痛,大便帶粘液及膿血等,疾病反復發(fā)作多數(shù)可誘發(fā)息肉,腺瘤,甚至癌癥。結(jié)腸直腸腺瘤是從腺上皮發(fā)生的一種良性腫瘤。它們可能存在于結(jié)腸的每一腸段中,并且在直腸和乙狀結(jié)腸中更常見,通常被分為三種類型:管狀,絨毛和混合型,是因為從組織學角度,它們有不同的形態(tài)特征,但不論哪種類型的腺瘤均存在不典型增生并具有惡變的傾向,也因此被認為是癌前病變。腺瘤轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y的風險與其大小,數(shù)量,絨毛特征和組織分化程度密切相關(guān)[1]。結(jié)腸直腸腺瘤可以演變成結(jié)腸直腸癌(CRC)。一項研究發(fā)現(xiàn),約80%的結(jié)腸直腸癌發(fā)生是由于結(jié)腸直腸腺瘤的發(fā)展,這個過程約需要5-10年[2]。因此,研究結(jié)直腸腺瘤發(fā)展到癌變的過程對發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌發(fā)病機制具有重要意義。而且潰瘍性結(jié)腸炎和結(jié)腸直腸腺瘤目前在其治療中具有復發(fā)特征。從病因角度分析,引起所有消化系統(tǒng)疾病的病因中細菌往往是其中的一個。眾多的研究中,目前公認的有:幽門螺桿菌感染是引起消化性潰瘍的重要因素;食管炎癥和腸上皮化生患者的食管粘膜菌群與健康者存在差異,因此食管炎癥和腸上皮化生的發(fā)病跟菌群變化存在關(guān)聯(lián)[3]。關(guān)于腸道菌群的研究越來越多,而且目前的研究已經(jīng)逐漸認識到在消化系統(tǒng)各種疾病發(fā)病機制中菌群相互作用的重要性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)功能性胃腸病的發(fā)病機制中有一條為:細菌是經(jīng)過參與到腸道微生物群的代謝過程而引起疾病,故而相互作用是發(fā)病機制中的重要因素[4]。所以,目前認為宿主和腸道微生物群是共生的,消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生腸道微生物群參與其中,但是宿主的基因,免疫和環(huán)境因素等會影響腸道微生物群的組成,腸道微生物也會在特定條件下破壞宿主的免疫和生理功能,導致病理改變,引起臨床癥狀。人體內(nèi)存在復雜的細菌,其中大多數(shù)是在胃腸道中,而在胃腸道中,絕大多數(shù)細菌又集中在結(jié)腸,結(jié)腸正是潰瘍性結(jié)腸炎與息肉的最容易發(fā)病部位。人類腸道中含有約1014個細菌微生物,這些細菌基本上以菌群(microbiota)的形式生存,共包含500-1000個不同種群[5]。據(jù)估計這些微生物的基因數(shù)量是人類基因組基因數(shù)量的200倍[6]。不同結(jié)腸腸段的菌群含量不同,菌群組成也不同,并且腸腔和其相關(guān)聯(lián)的粘膜上微生物菌群的數(shù)量和類型也是有差別的[7]。宿主能通過正常腸道菌群的存在得到獲益,如正常菌群可有助于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[8],起到生物拮抗作用,幫助營養(yǎng)物質(zhì)利用,促進維生素生物合成,保護粘膜[9]以及抗衰老作用。因此,保持正常菌群的合理存在有助于維持健康。菌群失調(diào)(dysbacteriosis),也就是腸道菌群紊亂,可能會導致或加重炎癥,是因為一旦條件允許某些過路菌或條件致病菌明顯增多成為有害細菌,打破了菌群平衡。研究還發(fā)現(xiàn),諸如抗生素相關(guān)性腹瀉[10],炎癥性腸病[11-12],自閉癥[13],肥胖[14]和腸易激綜合征[15]等疾病都與菌群失調(diào)有關(guān)。從動力學角度,宿主的生理狀態(tài)會嚴重影響腸道微生物菌群[16]。人類結(jié)直腸中大約存在著1014個細菌,如此龐大集體中的每個細菌必須為能從食物以及粘蛋白得到有限能量資源而展開激烈競爭[17]。腸道微生物菌群與宿主的生理狀態(tài)在正常情況下保持著平衡。腸道上皮的杯狀細胞分泌粘蛋白多糖供養(yǎng)粘膜相關(guān)菌群,杯狀細胞分泌產(chǎn)生的粘液量和組成的不同又取決于腸道菌群的局部信號以及腸道菌群本身[18]。腸道菌群可以為宿主提供有益的營養(yǎng)性信號,也可能提供不利的信號,成為疾病的危險因素,因此腸道菌群及其形成的多樣性和復雜性影響著腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)和疾病狀態(tài)[19]。如果宿主的粘膜生理狀態(tài)發(fā)生了變化,如炎性改變,會產(chǎn)生一些作為額外電位受體的氧化產(chǎn)物,引起兼性厭氧菌的數(shù)量明顯增加[20]。所以,宿主生理狀態(tài)的改變可引起腸道菌群的紊亂,兩者交互作用,進而導致出現(xiàn)病理改變。也就是腸道菌群與宿主之間的平衡一旦打破,菌群會通過能量吸收、內(nèi)毒素血癥、腦腸軸等多種途徑影響宿主健康[21]。在潰瘍性結(jié)腸炎和結(jié)直腸腺瘤時杯狀細胞的密度和功能通常都會降低,腸道菌群會出現(xiàn)改變,但目前粘膜菌群改變與何種因素相關(guān)的詳細研究仍然較少,需要進一步探索。近年以來,隨著對腸道菌群越來越重視,關(guān)于菌群的文獻資料數(shù)量也快速增長,這些研究主要基于16S rDNA序列分析[22],16S rDNA即核糖體16s小亞基基因(16S ribosomal subunit gene)。16S rDNA的堿基序列包含交錯排列的可變區(qū)和保守區(qū),保守區(qū)因其能夠在進化過程中保持穩(wěn)定,被用來設(shè)計細菌通用物;而可變區(qū)的差異可用來區(qū)分不同的細菌[23]。具體操作方法為收集腸粘膜或糞便樣本,然后從中提取細菌的16S rDNA基因片段,按照標準操作程序,利用高通量測序技術(shù)獲得其序列信息,然后比對16S rDNA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù),在系統(tǒng)進化樹上對該序列進行定位[24],以確定細菌的類型。高通量測序技術(shù)以其一次可并行大量測序及讀長較短等優(yōu)勢被廣泛應用,方法有很多,目前常用的包括:大規(guī)模平行簽名測序法、聚合酶克隆法以及454焦磷酸測序法、MiSeq測序等。我們將利用454焦磷酸測序方法和MiSeq測序方法對腸粘膜內(nèi)菌群進行研究分析。此外,腸道菌群具有潛在的診斷價值。Belcheva等[27]通過對結(jié)直腸癌相關(guān)細菌進行研究,發(fā)現(xiàn)細菌微生物及其代謝標志物可用于疾病的預測。Baxter等[28]對490例結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤病人和正常對照的糞便樣本利用16S rRNA基因測序的方法進行分析,構(gòu)建隨機森林模型,進而驗證模型的效能,發(fā)現(xiàn)其診斷效能優(yōu)異,受試者工作特征曲線下面積(Area under curve,AUC)為0.847。同課題組研究人員采用同樣的方法對404名結(jié)直腸癌病人糞便標本研究,構(gòu)建診斷模型,AUC為0.853[29]。Zeller等[30]對156名參與者的糞便樣本利用宏基因組測序技術(shù)進行分析,構(gòu)建診斷模型,AUC為0.84。在本研究中我們將基于腸粘膜菌群的分析,利用機器學習方法建立模型預測結(jié)直腸腺瘤,以探討腸粘膜菌群的診斷價值。近年來機器學習方法逐漸被應用于臨床診斷。機器學習方法就是一個從樣例歸結(jié)到計算機程序的過程,它具有強大的學習能力和推廣能力,學習能力為利用已知數(shù)據(jù)和知識從而發(fā)現(xiàn)規(guī)律。推廣能力為通過學習發(fā)現(xiàn)的規(guī)律不但能解釋已知數(shù)據(jù)和知識,還能對未知數(shù)據(jù)進行嚴謹?shù)念A測和判斷。它的操作過程為掌握已知數(shù)據(jù),然后通過設(shè)計算法以及模型進行學習,發(fā)現(xiàn)內(nèi)在的聯(lián)系,進而對未知的數(shù)據(jù)進行預測和判斷。支持向量機(Support Vector Machine,SVM)[31]是機器學習方法中的一種算法,它的優(yōu)勢體現(xiàn)在:小樣本研究、非線性以及高維模式識別。SVM能夠通過對有限的樣本信息進行分析獲得最大的推廣能力。參數(shù)選擇主要有三種方法:經(jīng)驗法[32-33];實驗法,主要有交叉驗證法[34];理論法,主要指基于函數(shù)集VC維的算法[35]。目前能否應用機器學習通過粘膜菌群的組成來判斷病變類型尚無研究。我們首次采用機器學習方法中的支持向量機算法判別腺瘤與非腺瘤病灶,并比較兩者準確率與魯棒性。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(Confocallaserendomicroscopy,CLE)的原理是把共聚焦激光顯微鏡與傳統(tǒng)消化內(nèi)鏡融合在一起,采集到的圖像可以放大至1000倍。使用熒光素鈉作為造影劑可以在傳統(tǒng)內(nèi)窺鏡檢查過程中對消化道粘膜進行實時“光學活檢”,以準確快捷地得到可以與組織活檢媲美的圖像。目前,新型共聚焦激光顯微內(nèi)窺鏡已經(jīng)發(fā)展成探針類型。它可以靈活地插入常見的消化道內(nèi)窺鏡活檢通道,收集腸粘膜的實時圖像。在探頭移動期間,能夠清晰地觀察到一定深度的組織和細胞。所以,CLE檢查時不僅能夠獲得組織的圖像,還能夠觀察粘膜上皮的生理病理狀態(tài)。CLE可用各種指標來評估腸黏膜的病理生理狀態(tài),如:上皮完整性[36-37],新血管生成[38-39]和炎性滲出[40]等。在CLE下潰瘍性結(jié)腸炎的特征可能表現(xiàn)為:隱窩的不規(guī)則排列,隱窩大小和數(shù)量的變化,隱窩融合,熒光素滲出和隱窩膿腫等。不同分期的特征會有所不同。多項與病理學對照的研究發(fā)現(xiàn)共聚焦激光顯微內(nèi)鏡對潰瘍性結(jié)腸炎炎癥活動度的診斷準確性、可行性均較高[40-42],其中Li等發(fā)現(xiàn)CLE可以準確判斷UC的炎癥活動程度;隱窩結(jié)構(gòu)、微血管改變和熒光素滲漏是CLE下判斷UC炎癥活動程度的主要依據(jù)[40]。在CLE下,結(jié)腸直腸腺瘤主要呈現(xiàn)為結(jié)構(gòu)上改變,包括不規(guī)則或絨毛狀隱窩,改變了的隱窩/間質(zhì)比例,隱窩被破壞,血管形態(tài)(包括直徑,數(shù)量,形態(tài)等)的變化以及熒光素滲出等,其次還有細胞的變化,包括上皮細胞異型,細胞極性變化,杯狀細胞減少甚至消失等。Kiesslich等人[43]觀察結(jié)腸鏡檢查患者,如果在過程中發(fā)現(xiàn)結(jié)腸息肉,則進一步行CLE檢查,并根據(jù)上皮細胞形態(tài),血管結(jié)構(gòu)和隱窩類型對CLE圖像進行前瞻性評估,對結(jié)腸息肉取活檢,將CLE圖像與病理圖像比對。研究發(fā)現(xiàn)CLE圖像和活檢標本的病理結(jié)果存在高度一致性,而且靈敏度、特異性以及準確性都很高,因此,CLE能夠用來預測新生物。同課題組進一步研究將5580幅共聚焦圖像與組織病理學結(jié)果比較,發(fā)現(xiàn)共聚焦預測瘤變的敏感性、特異性和準確性分別為94.7%、98.3%和97.8%[44]。所以,在CLE下可以很容易地判斷UC的炎癥活動程度和結(jié)直腸腺瘤的類型,也就是粘膜的病理生理狀態(tài),從而做出內(nèi)鏡診斷。另外,CLE的主要優(yōu)勢之一還表現(xiàn)在體內(nèi)評估和非侵入性。因此,CLE可用于鑒定目標粘膜,靶向活檢,進而對細菌進行測序和分析。在這項研究中,我們利用共聚焦激光顯微內(nèi)鏡對潰瘍性結(jié)腸炎和結(jié)腸直腸腺瘤做出診斷。靶向獲取病變部位粘膜,同時從正常部位粘膜取標本作為對照,利用高通量測序技術(shù)對收集的粘膜菌群16S rDNA基因序列進行提取,在此基礎(chǔ)上進行物種注釋,對腸粘膜菌群進行差異性分析,構(gòu)建進化樹,并探討腸粘膜菌群的診斷價值。目的本研究旨在就不同疾病狀態(tài)和不同活檢部位的腸粘膜菌群組成進行差異性分析,并探討腸粘膜內(nèi)菌群的診斷價值。方法本研究的研究對象選擇是2013年11月至2017年7月期間在山東大學齊魯醫(yī)院做高清結(jié)腸鏡檢查的患者。符合納入標準的受試者按常規(guī)使用高分辨率白光內(nèi)鏡進行檢查,在檢測到病灶后,進一步行pCLE檢查。病變部位和相鄰的正常對照部位均采用相同的方法檢查,并于內(nèi)鏡下進行診斷。將診斷的病變和正常粘膜取活檢,并且使用標準清洗方法以除掉粘膜表面上附著的細菌及糞便,標本被冷凍保存。按批次將粘膜標本的細菌DNA使用16S rDNA高通量測序方法測序。高通量測序數(shù)據(jù)返回后做基本處理,再采用mothur軟件分析,聚類0TU,進行物種注釋,按照取材部位和共聚焦內(nèi)鏡下的診斷類型比較腸粘膜菌群間的整體差異,構(gòu)建16s rDNA的進化關(guān)系,利用SVM方法判別腺瘤與非腺瘤病變,驗證腸粘膜菌群16s rDNA測序數(shù)據(jù)是否有診斷價值。結(jié)果在這項研究中,共篩查了 771名患者,并將其中的78名患者納入研究組進行最終數(shù)據(jù)分析。粘膜菌群經(jīng)高通量測序并處理后得到1,992,098條有效序列。按照0.97相似性聚類得到8,151個0TU,并進行物種注釋。對粘膜菌群的差異性分析表明腸粘膜活檢部位和病變類型均能影響腸粘膜菌群的組成,且活檢部位的影響更大。構(gòu)建出腸粘膜菌群16s rDNA基因的整體進化關(guān)系圖,該圖顯示了菌群之間的進化關(guān)系。每一個小分支是一個OTU的代表性序列,越靠近末端表示相鄰之間關(guān)系越近。腸粘膜菌群16s rDNA測序數(shù)據(jù)具有潛在的診斷價值。結(jié)論共聚焦激光顯微內(nèi)鏡是一個有用的工具,可用于評估人類在體粘膜的病理生理狀態(tài),有助于疾病早期診斷,方便靶向活檢。腸粘膜活檢部位和病變類型均能影響腸粘膜菌群的組成。腸粘膜菌群16s rDNA測序數(shù)據(jù)具有潛在的診斷價值。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R574.62
【圖文】：

采用距離依靠法計算兩兩序列間的差異，構(gòu)建腸粘膜菌群１６ｓ邋ｒＤＮＡ基因的整體逡逑進化關(guān)系，并以ＦｉｇＴｒｅｅ軟件（Ｖｅｒｓｉｏｎ邋１．４．２）進行可視化繪圖，分別以鐘形圖和逡逑樹形圖表示，見圖４。該系統(tǒng)進化樹展現(xiàn)了所得到的物種之間的關(guān)系，每條終端逡逑線段代表一個獨特序列，擁有各自的物種名稱，因其過于龐大，且在該研究中未逡逑對具體菌種展開分析，因此在繪制進化樹時將菌種名稱省去。線段長度代表與鄰逡逑近序列間的差異。越靠近末端表示相鄰之間的進化關(guān)系越近。系統(tǒng)進化樹的建立逡逑有利于進行序列同源性分析，方便研究未知菌種與其他菌種的親緣關(guān)系。逡逑圖４構(gòu)建腸粘膜菌群１６ｓ邋ｒＤＮＡ基因的整體進化關(guān)系。分別以鐘形圖（左）和樹逡逑２８逡逑

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本文編號：2766145