【摘要】：第一部分食管胃結(jié)合部平滑肌細胞原代培養(yǎng)及鑒定目的:探索最簡單、有效的原代食管胃結(jié)合部平滑肌細胞培養(yǎng)方法并鑒定平滑肌細胞特有表型。方法:選取2015年1月至2017年10月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院因中高位食管癌行食管大部切除術(shù)患者食管胃結(jié)合部平滑肌組織共24例,分別以酶消化法(enzymatic digestion with tissue blocks,ED)和組織塊法(explant culture with tissue blocks,EC-T)進行平滑肌細胞原代培養(yǎng)。ED組中,消化酶選擇膠原酶Ⅱ(collagenaseⅡ)和胰酶/EDTA消化液(Trypsin/EDTA),并以不同消化酶濃度結(jié)合不同消化溫度和消化時間探索最佳獲取原代細胞方法,記錄每200倍鏡視野可見貼壁細胞個數(shù)(Cells/200×)和原代細胞生長至第一次傳代所需時間(first passage day,FPD);EC-T組中,對比傳統(tǒng)組織塊貼壁法(explant culture with tissue blocks,T)與胰酶消化輔助法(explant culture with trypsin digested-tissue,TD-T)和直接利用酶消化法中組織塊內(nèi)注射膠原酶Ⅱ提取細胞后的剩余組織塊(explant culture with enzyme injected-tissue,EI-T)三種方法,記錄初次見到細胞由組織塊爬出時間(visibility of cells migration,VCM)、FPD、初次分瓶時已爬出細胞的組織塊所占比例(Positive blocks(%)),選擇效率最高的原代細胞培養(yǎng)方法;以CCK-8測定體外培養(yǎng)的細胞在平滑肌細胞培養(yǎng)基(smooth muscle cell medium,SMCM)和含10%新生牛血清的DMEM/F-12(10%-F12)培養(yǎng)基中的增殖的情況,并采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)、realtime RT-PCR、免疫熒光(immunofluore-scence,IF)、incellwestern方法檢測平滑肌組織和所獲得細胞中α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、平滑肌22α(smooth muscle 22α,SM22α)、波形蛋白(vimentin)、肌間線蛋白(desmin)、分化抗原簇90(cluster of differentiation 90,CD90)和增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表達情況,以對細胞進行鑒定。結(jié)果:ED和EC-T兩種方法均可獲得原代細胞。ED組以Cells/200×比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.864),但以FPD進行比較,可見以低濃度(0.5mg/ml)膠原酶Ⅱ注射入組織塊內(nèi)并低溫(4℃)、長時間(14~24h)消化所得細胞的時間最短(中位時間8.00d,P0.05);EC-T組中,以EI-T法獲得的原代細胞在VCM(中位時間6.00d,P0.05)、FPD(中位時間15.50d,P0.05)、Positive blocks(%)(中位比例86.00%,P0.05)方面均優(yōu)于其他兩種方法;ED組和EC-T組總FDP比較顯示ED組明顯短于EC-T組(P=0.000)。所培養(yǎng)原代細胞以梭型和長梭形為主,大小不均,可自行沿一定方向生長,表現(xiàn)為峰谷樣圖案;在SMCM中增殖良好,但在10%-F12中增殖效果不佳。這些細胞在SMCM中可傳代至第6~8代,但在10%-F12中僅可傳至第3~4代;細胞會隨著傳代次數(shù)增加體積逐漸增大并喪失梭形結(jié)構(gòu)。原代培養(yǎng)的細胞同相應(yīng)平滑肌組織一樣,均可檢測到α-SMA、SM22α、Vimentin、Desmin、CD90和PCNA的mRNA和蛋白,但不同體外培養(yǎng)條件下其平滑肌標志物表達水平不同,以10%-F12培養(yǎng)的細胞平滑肌標志物表達水平均高于SMCM組。結(jié)論:以平滑肌標志物鑒定ED法和EC-T法所獲得的細胞為平滑肌細胞,提取食管胃結(jié)合部平滑肌細胞進行體外培養(yǎng)是可行的;ED法獲得的細胞培養(yǎng)周期短;以SMCM培養(yǎng)平滑肌細胞可有效擴大細胞種群,但以10%-F12培養(yǎng)的細胞具有更好的平滑肌細胞表型。第二部分乙酰膽堿對體外培養(yǎng)人食管胃結(jié)合部平滑肌細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響目的:使用乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)對體外培養(yǎng)的人食管胃結(jié)合部(esophagogastric junction,EGJ)平滑肌細胞內(nèi)鈣熒光變化的影響,明確各種平滑肌細胞內(nèi)鈣熒光變化特點,確定最佳體外人源性EGJ平滑肌細胞培養(yǎng)方式。方法:選取2016年11月至2017年10月因中高位食管癌行食管大部切除術(shù)患者共9例,以酶消化法和組織塊法獲取套索纖維、鉤狀纖維、食管環(huán)行肌、食管縱行肌、胃小彎側(cè)環(huán)行肌和胃大彎側(cè)環(huán)行肌6種人EGJ原代平滑肌細胞并分別以平滑肌培養(yǎng)基(smooth muscle cell medium,SMCM)和含10%新生牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基(10%-F12)進行培養(yǎng)。以5μmol/L Fluo-3/am溶液負載體外培養(yǎng)的SMCM第3代和10%-F12第2代EGJ平滑肌細胞,在共聚焦顯微鏡下觀察10~-66 mM Ach對有鈣緩沖液和無鈣緩沖液中平滑肌細胞內(nèi)鈣熒光的影響,記錄熒光活動的起始值、峰值和結(jié)束值并記錄相應(yīng)時間長度,對比同種組織來源細胞鈣熒光在有鈣緩沖液和無鈣緩沖液以及鈣活動前后的差異。結(jié)果:不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的EGJ平滑肌細胞存在不同的基礎(chǔ)鈣熒光。各組細胞加入Ach約2 s后即可見細胞內(nèi)鈣熒光變化。食管縱行肌細胞、胃大彎側(cè)環(huán)形肌細胞和胃小彎側(cè)環(huán)形肌細胞鈣熒光活動相對于套索纖維細胞、鉤狀纖維細胞和食管環(huán)行肌細胞溫和。在含鈣緩沖液中,各種細胞的基礎(chǔ)鈣熒光強于無鈣緩沖液,且鈣活動總時間長,但熒光峰值不高。在無鈣緩沖液中,酶消化法獲得的細胞鈣熒光更多見典型的細胞內(nèi)存儲鈣離子釋放,且仍可見較長時間鈣活動。鉤狀纖維、套鎖纖維、食管環(huán)行肌和胃小彎側(cè)環(huán)形肌以細胞內(nèi)存儲鈣離子釋放為主要特點,而食管縱行肌、胃大灣環(huán)形肌以細胞外鈣離子內(nèi)流為主要特點;以酶消化法獲取并以10%-F12培養(yǎng)的鉤狀纖維細胞、套索纖維細胞、食管環(huán)行肌細胞和食管縱行肌細胞在有鈣緩沖液和無鈣緩沖液中的鈣離子活動峰值熒光差均有統(tǒng)計學(xué)差異。組織塊法獲取的細胞中,僅胃大彎側(cè)環(huán)行肌和以10%-F12培養(yǎng)的套索纖維細胞峰值熒光差存在統(tǒng)計學(xué)差異,且各組細胞鈣活動特點不如酶消化法組細胞典型。結(jié)論:在Ach誘發(fā)體外培養(yǎng)的EGJ平滑肌細胞內(nèi)鈣熒光變化過程中,鉤狀纖維、套鎖纖維、食管環(huán)行肌、食管縱行肌、胃大彎側(cè)環(huán)形肌和胃小彎側(cè)環(huán)形肌均不單純依賴于某種鈣離子活動,而是將細胞內(nèi)存儲鈣離子釋放與細胞外鈣離子內(nèi)流相結(jié)合以有效維持較長時間的鈣活動。以酶消化法獲取細胞并以10%-F12進行培養(yǎng)是最佳體外人EGJ平滑肌細胞培養(yǎng)方式。第三部分鈣離子相關(guān)蛋白及一氧化氮合酶在賁門失弛緩癥患者腹段食管環(huán)行肌中表達的初步研究目的:明確參與細胞內(nèi)Ca~(2+)變化的相關(guān)鈣離子蛋白和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)在賁門失弛緩癥(achalasia of the cardia,AC)患者腹段食管段環(huán)行肌的表達。方法:收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科AC患者共10例為實驗組,選取因中高位食管癌行食管大部切除術(shù)患者共17例為對照組。手術(shù)中收集兩組賁門水平以上2~5cm以內(nèi)腹段食管環(huán)行肌組織。以L-型鈣離子通道(L-type calcium channel,LTCC)、三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-triphosphate recptors,IP_3Rs)、雷諾定受體(ryanodine receptors,RyRs)三種大分子蛋白和NOS為研究對象,分別采用realtime RT-PCR和免疫組織化學(xué)(SP法)技術(shù)檢測LTCC、RyRs、IP_3Rs和NOS各亞型在實驗組與對照組表達的差異,同時以RT-PCR擴增各cDNA并進行堿基測序以明確判斷相應(yīng)mRNA是否表達。檢驗實驗組各受體mRNA相對表達量與食管綜合松馳壓(integrated relaxation pressure,IRP)是否存在線性關(guān)系。結(jié)果:通過對實驗組和對照組腹段食管環(huán)行肌(esophageal circular smooth muscle of control,EC)組織cDNA擴增顯示,各蛋白亞型mRNA中i NOS、n NOS、Cav1.2、Cav1.3、RyR2、IP_3R1、IP_3R2和IP_3R3在兩組中均為陽性表達,但eNOS、Cav1.1、RyR1、RyR3不表達;經(jīng)統(tǒng)計分析,iNOS、n NOS、Cav1.3、IP_3R1和IP_3R2的mRNA在AC表達均增高;iNOS和Cav1.3相對mRNA表達量與IRP之間存在正相關(guān)關(guān)系。通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測,在實驗組和對照組平滑肌組織中n NOS、Cav1.2、Cav1.3、IP_3R1、IP_3R2、IP_3R3和RyR2 7種蛋白均表達,其中n NOS局限分布于AC平滑肌組織中的神經(jīng)纖維并呈強陽性染色,但平滑肌細胞質(zhì)染色較對照組明顯淺淡。經(jīng)統(tǒng)計分析僅IP_3R2在AC表達升高且與mRNA表達情況一致,兩組中其余蛋白表達無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論:在賁門失弛緩癥患者腹段食管環(huán)行肌病理變化中,NOSs依然參與食管平滑肌病理狀態(tài)的調(diào)節(jié),但iNOS mRNA異常增高且n NOS在平滑肌細胞的表達明顯減少;鈣離子相關(guān)蛋白表達異常的肌源性因素也許在賁門失弛緩癥病理生理機制中扮演著重要角色。結(jié)論:1.以平滑肌標志物鑒定酶消化法和組織塊法所獲得的食管胃結(jié)合部平滑肌組織來源的細胞為平滑肌細胞,提取食管胃結(jié)合部平滑肌細胞進行體外培養(yǎng)是可行的。在酶消化法中,以低濃度(0.5mg/ml)膠原酶Ⅱ注射于組織塊并在低溫(4℃)、長時間(14~24h)條件下消化的方法獲取平滑肌細胞效率最佳且細胞培養(yǎng)周期短;以此殘余組織塊直接用于組織塊培養(yǎng)法,其獲取平滑肌細胞的效率最佳。體外培養(yǎng)的平滑肌細胞以合成型為主,形態(tài)學(xué)表現(xiàn)多為梭型和長梭形;在不同培養(yǎng)條件下其平滑肌特異性標志物的表達水平不同;以專業(yè)培養(yǎng)基培養(yǎng)平滑肌細胞可有效擴大細胞種群,但以含10%新生牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)的平滑肌細胞擁有更好的平滑肌細胞表型。2.在Ach誘發(fā)體外培養(yǎng)的食管胃結(jié)合部平滑肌細胞內(nèi)鈣熒光變化過程中,體外培養(yǎng)的鉤狀纖維、套鎖纖維、食管環(huán)行肌和胃小彎側(cè)環(huán)形肌細胞以細胞內(nèi)存儲鈣離子釋放為主要特點;食管縱行肌、胃大彎側(cè)環(huán)形肌細胞以細胞外鈣離子內(nèi)流為主要特點。但以上細胞均不單純依賴于某種鈣離子活動,而是將細胞內(nèi)存儲鈣離子釋放與細胞外鈣離子內(nèi)流相結(jié)合以有效維持較長時間的鈣活動,尤以酶消化法獲取并以含10%新生牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基進行培養(yǎng)的平滑肌細胞在乙酰膽堿介導(dǎo)的細胞內(nèi)鈣離子濃度變化中表現(xiàn)最佳,可作為最佳人EGJ平滑肌細胞體外培養(yǎng)方式。3.在賁門失弛緩癥患者腹段食管環(huán)行肌病理變化中,一氧化氮合酶依然參與食管平滑肌病理狀態(tài)的調(diào)節(jié),但誘生型一氧化氮合酶mRNA異常增高且神經(jīng)元型一氧化氮合酶在平滑肌細胞的表達明顯減少。鈣離子相關(guān)蛋白表達異常的肌源性因素也許在賁門失弛緩癥病理生理機制中扮演著重要角色,其與一氧化氮合酶的相應(yīng)變化在賁門失弛緩癥病理生理過程中的作用應(yīng)受到關(guān)注。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R571
【圖文】：

圖 1 食管胃結(jié)合部（黏膜側(cè)）Fig. 1 Mucosa side of esophagogastric junction圖 2 酶消化法獲得的食管胃結(jié)合部原代細胞

酶消化法獲得的食管胃結(jié)合部原代細胞Fig.2Primarycellsofesophagogastricjunction(EGJ)obtainedby

圖 3 不同酶消化法獲得原代細胞的比較Fig. 3 Comparison of different ED methods to obtain primary cellsThere was no statistical difference in Cells/200× (P=0.864), but it wasstatistical different to compare 0.5-EI-4 with 0.5-C-4 (P=0.006) and 0.25-T-37(P=0.004) in the first passage day (FPD) respectively. (*P＜0.05)圖 4 未經(jīng)酶消化輔助（T 組）組織塊中細胞生長示圖（×100，以 EC 為例）Fig. 4 Primary esophageal circular muscle (EC) cells obtained by traditional

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本文編號：2765377