【摘要】：肝纖維化(liver fibrosis)是由于病毒、代謝、遺傳和膽汁淤積等多種原因?qū)е乱约?xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)過(guò)度沉積為特征的慢性肝損傷。肝纖維化最終導(dǎo)致肝硬化,部分進(jìn)展為肝癌,因此肝纖維化是一個(gè)世界性的公共健康問(wèn)題。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)是產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞來(lái)源,是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。 肝星狀細(xì)胞是肝臟的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞,主要以儲(chǔ)存維生素A的靜止形式存于正常肝臟中。然而,大量體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)多種致病因素作用致肝損傷,HSC失去維生素A變?yōu)楸磉_(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的活化的HSC,并不斷增殖,分泌豐富的I型膠原而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。多種細(xì)胞因子可以導(dǎo)致HSC增殖和膠原合成,如:血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor, EGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 (transforming growth factor beta 1, TGF-β1)。因此,探討HSC活化增殖的的機(jī)制,可能為肝纖維化治療提供新的思路。 肝素結(jié)合性表皮生長(zhǎng)因子(heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor, HB-EGF)是表皮生長(zhǎng)因子受體家族的配體之一,可以結(jié)合并激活表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR/ErbB1)和ErbB4受體,進(jìn)而激活絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。最近的研究表明,HB-EGF能夠刺激多種細(xì)胞增殖。CRM197是一種無(wú)毒性的白喉毒素突變體,是HB-EGF的特異性抑制劑,通過(guò)結(jié)合可溶性的HB-EGF阻斷它與ErbB受體的結(jié)合和下游的信號(hào)反應(yīng)。 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinase, ERK)是MAPK家族成員之一,PDGF和EGF等多種細(xì)胞因子通過(guò)各自受體激活Ras/Raf/ ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,傳導(dǎo)細(xì)胞增殖信號(hào)。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt信號(hào)通路可被多種生長(zhǎng)因子和促有絲分裂原活化,對(duì)調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞分化和細(xì)胞生長(zhǎng)起重要作用。Ras/Raf/ERK和PI3K/Akt信號(hào)通路在HSC的增殖、凋亡和膠原合成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。 本課題旨在研究HB-EGF對(duì)兩種HSC細(xì)胞株(人HSC細(xì)胞株LX2和大鼠HSC細(xì)胞株T6)和原代HSC增殖和凋亡的影響及可能的分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)由以下三部分組成: 第一部分:HB-EGF在原代大鼠HSC中的表達(dá) 目的:研究HB-EGF在HSC活化過(guò)程中的作用。 方法:采用鏈酶、IV型膠原酶原位灌注肝組織和Nycodenz梯度離心技術(shù)分離大鼠原代HSC,采用熒光顯微鏡和α-SMA做免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法鑒定原代HSC。用免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測(cè)靜止和激活的原代HSC中HB-EGF、phospho-EGFR、EGFR和ErbB4的表達(dá);Western Blot檢測(cè)CRM197干預(yù)靜止?fàn)顟B(tài)的HSC后phospho-EGFR、EGFR和ErbB4的表達(dá)。 結(jié)果:①HSC的細(xì)胞的得率為1.5～2.0×107/只,細(xì)胞存活率和純度均大于90%。剛分離的HSC呈圓形,胞漿內(nèi)含有豐富的脂滴,在波長(zhǎng)328 nm的熒光顯微鏡下觀察,能激發(fā)出熒光。HSC培養(yǎng)10天,靜止的細(xì)胞變?yōu)榛罨癄顟B(tài),富含維生素A的脂滴消失,變?yōu)樗笮位蛐切�。②大鼠原代HSC性質(zhì)鑒定。未激活的HSC內(nèi)不表達(dá)α-SMA;細(xì)胞培養(yǎng)14天后,全部激活的HSC胞漿內(nèi)呈現(xiàn)α-SMA表達(dá)。③HB-EGF及ErbB受體在原代大鼠HSC激活后表達(dá)明顯增加。剛分離的大鼠原代HSC內(nèi)幾乎不表達(dá)HB-EGF及其受體;而激活后的HSC內(nèi)HB-EGF和ErbB受體表達(dá)明顯增加�？偟腅GFR在原代HSC激活前后表達(dá)水平無(wú)明顯差異。④CRM197對(duì)靜止的大鼠HSC無(wú)明顯作用。CRM197 (20μg/ml)干預(yù)剛分離的大鼠原代HSC,EGFR的磷酸化和ErbB4水平與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。 結(jié)論:靜止?fàn)顟B(tài)的原代大鼠HSC內(nèi)幾乎沒(méi)有HB-EGF的表達(dá),而HSC激活后HB-EGF表達(dá)明顯增加,HB-EGF在原代HSC激活前后的改變可能預(yù)示著肝纖維化與HB-EGF這種細(xì)胞因子及其由它激活的下游信號(hào)通路密切相關(guān)。 第二部分:HB-EGF促進(jìn)HSC增殖、抑制凋亡 目的:探討HB-EGF和CRM197在HSC增殖和凋亡中的作用。 方法:HB-EGF不同濃度(10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml)和時(shí)間點(diǎn)(12 h, 24 h, 48 h)干預(yù)活化的人HSC株LX2、大鼠HSC株T6和原代大鼠HSC,四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化、溴脫氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine, BrdU)標(biāo)記的摻入法測(cè)定細(xì)胞DNA合成。以20μg/ml CRM197、5μmol/L AG1478、50μmol/L PD98059和25μmol/L LY294002同時(shí)干預(yù)經(jīng)HB-EGF (40 ng/ml)刺激的HSC-LX2、T6和原代大鼠HSC,MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖變化、BrdU摻入檢測(cè)HSC DNA合成。CRM197預(yù)處理細(xì)胞24小時(shí)后更換培養(yǎng)基,給予HB-EGF 40 ng/ml干預(yù)LX2和T6和原代大鼠肝星狀細(xì)胞24 h,透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標(biāo)記(terminal deoxynucleotidy transferrase UTP-nick end labeling, TUNEL)檢測(cè)HSC凋亡。CRM197預(yù)處理細(xì)胞24小時(shí)后,給予HB-EGF (10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml)干預(yù)HSC-T6和LX2細(xì)胞株12 h,24 h和48 h。膜聯(lián)蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(Propidium iodide, PI)聯(lián)合標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC凋亡率和Caspase-3活性。以20μg/ml CRM197、5μmol/L AG1478、50μmol/L PD9805925和25μmol/L LY294002同時(shí)干預(yù)經(jīng)HB-EGF (40 ng/ml)刺激的HSC-LX2、T6和原代大鼠HSC,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果:①HB-EGF能刺激人HSC株LX2、大鼠HSC株T6和原代HSC增殖。MTT檢測(cè)顯示不論CRM197抑制與否,HB-EGF均呈濃度和時(shí)間依賴性的刺激以上三種細(xì)胞增殖,其中HB-EGF高劑量組(40 ng/ml)干預(yù)24 h,使LX2、T6和原代HSC細(xì)胞增殖分別較對(duì)照組的100%增加至137.11±8.44% (P0.05)、138.74±6.21% (P0.05)和129.92±4.68% (P0.05);CRM197能抑制HB-EGF刺激后引起的HSCs增殖。②PDGF (20 ng/ml)刺激三種HSC增殖與HB-EGF (40 ng/ml)刺激增殖的作用相比無(wú)明顯差異;CRM197發(fā)揮了與EGFR受體阻斷劑類似的抑制作用。AG1478顯著抑制了HB-EGF刺激的HSC增殖,與CRM197的抑制作用相比無(wú)明顯差異;PD98059和LY294002均分別顯著抑制了HB-EGF刺激后HSCs的增殖,與CRM197的抑制作用相比顯著增加。③HB-EGF呈濃度和時(shí)間依賴性地刺激HSC DNA合成。BrdU-DNA摻入法測(cè)定結(jié)果顯示HB-EGF高劑量組(40 ng/ml)干預(yù)24 h,使LX2、T6和原代HSC細(xì)胞DNA合成分別較對(duì)照組的100%增加至160.77±13.62% (P0.05)、154.33±5.55% (P0.05)和130.92±1.74% (P0.05);CRM197能夠明顯抑制HB-EGF刺激后引起的HSC DNA合成。④CRM197抑制人HSC株LX2、大鼠HSC株T6和原代HSC DNA合成,較HB-EGF刺激組相比明顯降低(68.87±5.57% vs 160.90±13.57%, P0.05; 74.67±4.43% vs 154.33±5.55%, P0.05; 76.30±6.85% vs 130.92±1.74%, P0.05);AG1478、PD98059和LY294002均分別顯著抑制了HB-EGF刺激后HSC的DNA合成。⑤透射電鏡下觀察HSC形態(tài)變化。濃度為20μg/ml的CRM197干預(yù)HSC 24 h后,細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡特征:細(xì)胞體積變小,染色質(zhì)凝集,新月體形成,核膜皺褶,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。⑥與對(duì)照組相比,20μg/ml CRM197分別提高LX2、T6和原代HSC細(xì)胞TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞率8.87倍(P0.05), 7.54倍(P0.05)和6.54倍(P0.05)。⑦HB-EGF抑制Caspase-3活性;20μg/ml CRM197分別將LX2、T6和原代HSC細(xì)胞Caspase-3的活性提高了1.56倍(P0.05), 1.65倍(P0.05)和1.70倍(P0.05)。 結(jié)論:HB-EGF能夠刺激HSC增殖和DNA合成;CRM197能夠誘導(dǎo)HSC凋亡,這種作用可能與Caspase-3的活性相關(guān)。 第三部分:HB-EGF對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡影響的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 目的:探討HB-EGF對(duì)HSC細(xì)胞內(nèi)ErbB受體以及下游的ERK和Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)作用。 方法:HB-EGF或CRM197干預(yù)HSC 24 h后,免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測(cè)EGFR、ErbB4和p-EGFR的蛋白表達(dá)變化。經(jīng)或不經(jīng)CRM197 (20μg/ml)干預(yù)HSC 24 h后,以不同濃度的HB-EGF (10 ng/ml, 20 ng/ml, 40 ng/ml)刺激HSC-T6、LX2細(xì)胞株和原代大鼠HSC 24 h,Western blot檢測(cè)EGFR、ErbB4、ERK、Akt、p-EGFR、p-ERK和p-Akt的蛋白表達(dá)變化;RT-real time PCR測(cè)定EGFR和ErbB4 mRNA的表達(dá)。經(jīng)或不經(jīng)CRM197 (20μg/ml)干預(yù)HSC 24 h后,以HB-EGF (40 ng/ml)刺激HSC-T6、LX2細(xì)胞株和原代大鼠HSC 12 h,24 h和48 h,Western blot檢測(cè)EGFR、ErbB4、ERK、Akt、p-EGFR、p-ERK和p-Akt的蛋白表達(dá)變化;RT-real time PCR測(cè)定EGFR和ErbB4 mRNA的表達(dá)。以20μg/ml CRM197、5μmol/L AG1478、50μmol/L PD98059和25μmol/L LY294002同時(shí)干預(yù)經(jīng)HB-EGF (40 ng/ml)刺激的HSC-LX2、T6和原代HSC,橫向比CRM197與三種抑制劑對(duì)以上信號(hào)分子的作用。 結(jié)果:①在HSC細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均表達(dá)ErbB受體,HB-EGF能刺激HSC中p-EGFR和ErbB4表達(dá)增加;CRM197抑制p-EGFR和ErbB4的表達(dá)。②HB-EGF刺激HSC中ErbB4 mRNA水平表達(dá)增加;EGFR mRNA水平在原代HSC的各組間變化不明顯。③HB-EGF上調(diào)兩種HSC細(xì)胞株(LX2、T6)和原代HSC中ErbB受體和下游的ERK、Akt信號(hào)分子磷酸化水平,呈時(shí)間和劑量依賴性;CRM197抑制HB-EGF激活的LX2、T6和原代HSC內(nèi)ErbB受體的表達(dá),繼而抑制了ERK和Akt信號(hào)通路的磷酸化。④CRM197發(fā)揮了與EGFR受體相應(yīng)阻斷劑類似的抑制作用。AG1478抑制了HB-EGF刺激后EGFR受體的磷酸化水平,繼而抑制了下游的ERK和Akt信號(hào)分子的磷酸化水平,而CRM197則同時(shí)抑制了EGFR受體的磷酸化和ErbB4受體。⑤CRM197發(fā)揮了與ERK和Akt信號(hào)通路相應(yīng)阻斷劑類似的抑制作用。PD98059和LY294002均分別顯著抑制了HB-EGF刺激后HSC內(nèi)ERK和Akt信號(hào)分子的磷酸化水平,而CRM197則同時(shí)抑制了HB-EGF刺激后這兩條信號(hào)通路的磷酸化,但是與PD98059和LY294002的抑制作用相比顯著降低。 結(jié)論:HB-EGF可能通過(guò)EGFR和ErbB4受體,激活ERK和Akt兩條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,實(shí)現(xiàn)促進(jìn)HSC增殖、抑制HSC凋亡的作用。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2763176